茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及表达分析

[目的]克隆茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)基因(JsPMK),对其进行生物信息学分析并检测其表达时间节律性,为深入研究茉莉花萜类化合物生物合成途径及其调控机制提供理论参考.[方法]以茉莉花花瓣为材料,采用RT-PCR扩增JsPMK基因全长,利用生物信息学软件对其编码蛋白进行预测分析,并采用qRT-PCR检测JsPMK基因在茉莉花开放过程中的表达情况.[结果]克隆获得的JsPMK基因(GenBank登录号为MH311042)全长1951 bp,包含1518 bp完整的开放阅读框(ORF),共编码505个氨基酸,其编码蛋白定位于细胞质,为稳定的非分泌蛋白.JsPMK蛋白含有GHMP激酶N端保守区和C端保守区,且在N端保守区含一个ATP结合位点Gly-X-Gly-XX-Ala.JsPMK蛋白与野生油橄榄、芝麻、丹参和番茄的PMK蛋白氨基酸序列相似性均较高(在80%以上),其中与野生油橄榄亲缘性最近,表明不同植物PMK蛋白高度保守.JsPMK基因在未开放(18:00)时表达量最低,随着茉莉花逐渐开放,JsPMK基因表达量极显著上升(P<0.01,下同),在20:00达最大值,随后表达量极显著下降.[结论]JsPMK基因表达可能受生物钟调控,在茉莉花萜类化合物合成和香气释放中发挥重要的调控作用.     

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明,该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性,其中与青木香的同源性最高,达到82%。实时荧光定量PCR结果表明,CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】克隆得到了红花CHI基因,其在红花花蕾期的表达量最高。     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2 947 bp,开放阅读框(ORF)2 418 bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1 receptor)。该蛋白的分子量为91.15 kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%～35%,TIR序列的同源性达到84%～62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

弗氏链霉菌tylF基因的克隆及其生物信息学分析

[目的]研究弗氏链霉菌tylF基因的克隆及其生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR技术、巢式PCR技术和RACE技术从弗氏链霉菌B-62169菌株中克隆获得tyl F基因的全长c DNA序列,并对其生物信息学进行分析。[结果]经Vector NTI 11.0软件拼接获得tyl F基因全长c DNA序列长度为1 245 bp,并带有19 bp长的Poly(A)尾巴,包含927 bp的开放读码框(ORF),编码一个含309个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明,tyl F基因编码的酶是大菌素-O-甲基转移酶,参与分子功能中甲基转移酶活性和生物学途径中甲基化过程。对tyl F基因全长c DNA序列进行蛋白质结构域分析,证实该基因编码Tyl F蛋白,并具有223个氨基酸蛋白结构域。[结论]该研究为阐明泰乐菌素生物合成过程中甲基化反应机理,更进一步研究大环内酯类抗生素生物合成代谢途径提供生物信息学数据支持。     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析(英文)

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2947bp,开放阅读框(ORF)2418bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1receptor)。该蛋白的分子量为91.15kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%~35%,TIR序列的同源性达到84%~62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

‘亚历山大’葡萄果实单萜生物合成相关基因转录及萜类物质积累规律

【目的】检测‘亚历山大’葡萄果实中萜类物质的种类和含量,分析果实发育过程中单萜类物质的积累与相关基因表达的关系,为揭示玫瑰香型葡萄香气物质的积累规律和香味育种奠定基础。【方法】从果实转色后至成熟期,每周取样一次,每次随机取样80-100粒,去籽去梗后榨汁,离心取上清液用于香气物质测定,使用顶空固相微萃取方法萃取样品中的挥发性成分,对采集到的质谱图用NIST 05谱库检索,并根据已有标样的色谱保留时间和保留指数,确定香气成分的化学组成,利用已有的化合物制备标准曲线进行定量。根据DXS的ORF序列设计引物,以充分成熟的样品RNA反转录获得的cDNA为模板,通过多次独立PCR扩增获得‘亚历山大’DXS的ORF片段,根据测序结果分析单核苷酸多态性位点。根据萜类生物合成途径中的8个关键酶基因序列设计引物,使用Ubiquitin,EF1-α和GAPDH 3个看家基因做为内参,进行实时定量PCR,检测这些基因的转录丰度。【结果】从转色后至成熟期,在检测到的所有单萜中里那醇和香叶醇的含量远高于其它单萜,多种萜类浓度逐渐上升,其中里那醇、月桂烯、柠檬烯上升6-8倍,香叶醇、萜品醇、香叶醛和萜品油烯上升2-3倍,玫瑰醚和橙花醛含量变化较小,果实中里那醇、香叶醇、氧化玫瑰和月桂烯的含量高于嗅闻阈值。在单萜生物合成早期途径中,DXS1的表达从转色开始缓慢上升,在花后15周迅速上调,上升约5倍。DXS3则从12周开始迅速上升。DXR表现出波动变化规律。HDR的表达量在前期合成酶基因中是最高的,能达到DXS1、DXS3、DXR的10-20倍;在合成途径中期的2个基因FPPS和GPPS,从转色后至成熟期表达量持续上调,FPPS的表达量上升了4倍,GPPS的表达量上升了2倍;在合成途径的后期,Liner-syn和Terp-syn在花后的11-15周都出现表达量升高,所有基因在花后17周出现明显的表达下降。单萜总量从花后12-16周迅速积累,这与同期DXS3、DXR、HDR、GPPS、FPPS的表达上调的趋势相一致。通过相关性分析结果显示萜类总量与DXS3的相关系数为0.831。‘亚历山大’DXS1的cDNA的开放阅读框全长2 151 bp,编码716个氨基酸,通过多次独立克隆后对测序结果进行比对,在该序列中发现了16个单核苷酸多态性位点,导致4个位置编码的氨基酸发生变化。【结论】单萜合成途径中多个关键酶基因后期表达上调,导致成熟过程中单萜化合物含量上升2-8倍,DXS3与单萜总量的积累具有显著的相关性。     

青鳉的一种PABP基因电子克隆及其鉴定

[目的]克隆分析青鳉的一种脚基因。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鳉的一种PABP基因的全长cDNA序列,并对其序列进行了分析。[结果]该eDNA序列包含780bp的开放阅读框,编码259个氨基酸。氨基酸序列同源性和进化的分析表明,青鲋的PABP蛋白与半滑舌 鳎ePABP2具有较高的同源性。[结论]所获得的青鲋的脚基因与其他物种的ePABP2基因同源。     

卷叶贝母1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因的克隆与表达分析

【目的】MEP途径是合成生物碱、萜类物质前体的重要途径之一,1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS)是MEP途径中的第1个限速酶。为了解卷叶贝母DXS的结构和功能特点,本研究利用分子生物学手段对其进行分析,以期为贝母生物碱合成途径研究打下基础。【方法】采用PCR技术克隆卷叶贝母FcDXS基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,运用生物信息学方法对其进行序列分析,预测其潜在的功能。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测FcDXS基因在野生状态(根、茎、叶、鳞茎)和组培诱导物(愈伤组织)中的表达情况。【结果】获得了2151 bp FcDXS基因ORF片段,编码716个氨基酸,并与NCBI公布的砂仁等植物DXS蛋白相似性达80%以上;在Fc DXS蛋白的二级、三级结构预测中,得出Fc DXS蛋白主要由α螺旋构成; qRTPCR检测结果表明FcDXS基因在野生状态下鳞茎表达量最高,激素诱导状态的愈伤组织表达量则是野生鳞茎的5倍。【结论】Fc DXS蛋白质特征区及同源性等生物信息学分析表明该蛋白的结构域较保守,结合荧光定量分析结果证明,Fc DXS是一个有生物学功能且受激素诱导表达的蛋白质。本研究为后续利用基因工程手段提高卷叶贝母生物碱含量奠定了理论基础。     

南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

[目的]克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据.[方法]采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能.[结果]克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸.TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%.TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体.TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中.TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达.大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累.[结论]不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用.     

一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析

【目的】克隆亚洲棉MYB家族的一个新基因（GaMYB2）,研究其表达模式,分析其预期编码蛋白。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆亚洲棉MYB2的cDNA序列全长;应用生物信息学软件分析该基因及预期编码蛋白的特征;采用实时荧光定量PCR技术对该基因的组织特异性和PEG6000模拟干旱胁迫处理下的表达模式进行分析。【结果】从亚洲棉(Gossypium arboreum L.)中克隆了MYB家族的一个新基因MYB2,该基因全长1 117 bp,ORF全长840 bp,编码279个氨基酸,含有MYB保守域,氨基酸的BALSTP分析表明GaMYB2氨基酸序列与已报道的水稻（BAA23338.1）、小麦(AAT37168.1)等的序列有40.50%到68.20%的相似性。亚细胞定位表明该基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明该基因在根和花中的表达量较高,并且响应17%的PEG6000模拟干旱胁迫处理,上调表达。【结论】GaMYB2是亚洲棉MYB家族的一个新基因,并认为该基因可能在棉花调控干旱胁迫的生理适应过程中发挥重要作用。     

茉莉花JsGGPPS基因的克隆及生物信息学与表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgerany pyrophosphate synthase,GGPPS)是萜烯类香气物质合成途径中的关键酶。采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆了茉莉花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的全长cDNA(命名为JsGGPPS,GenBank登录号AIY24421.1),采用实时荧光定量PCR技术分析JsGGPPS基因在茉莉花开放过程中的表达模式。结果表明,JsGGPPS全长cDNA为1 410bp,含1 083bp完整的开放阅读框(ORF),其推导的氨基酸序列包含360个氨基酸,属于trans-isoprenyl diphosphate synthases(IPPS)和class I terpene cyclases家族,含链长控制区(CLDR)、2个天冬氨酸富集区以及其他保守区。JsGGPPS基因与独行菜Lepidium apetalum、橡胶草Taraxacum kok-saghyz的同源性分别为91%、86%。实时荧光定量PCR结果表明,茉莉花开放过程中JsGGPPS基因在晚上18:00时表达量较低,呈上调趋势,在22:00时达到最高,呈下调趋势,在翌日2:00时表达量最低,与茉莉花释香趋势相似,为深入研究茉莉花萜烯类香气物质代谢途径奠定基础。     

黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因CsTPST克隆及其表达分析

【目的】克隆黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因(CsTPST),并分析植物多肽在发育过程中的调控作用,为研究CsTPST的功能及多肽与乙烯在黄瓜发育过程中的相互作用打下基础。【方法】以拟南芥TPST蛋白序列信息为基础进行同源比对,经PCR扩增和生物信息学分析获得CsTPST基因序列信息、结构和亲缘关系,并利用qRT-PCR对其表达模式进行分析。【结果】CsTPST基因cDNA全长789 bp,编码262个氨基酸。进化分析结果表明,CsTPST蛋白与甜瓜的TPST蛋白亲缘关系最近,其氨基酸序列相似性为93%。 qRT-PCR分析结果表明,CsTPST基因在黄瓜雌花、根和叶片中表达量较高,在雄花和茎中表达量较低。此外,CsTPST基因在乙烯合成促进剂ACC处理的黄瓜叶片中上调表达,而在乙烯合成抑制剂AVG处理下呈下调表达。 CsTPST基因启动子能激活GFP基因的表达。【结论】CsTSPT基因是一个受乙烯诱导表达的基因,可供开展CsTPST基因的生物学功能及性别决定的分子机理研究参考。     

羽衣甘蓝BoRACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆羽衣甘蓝蛋白激酶C1受体(RACK1)基因(BoRACK1)序列,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的调控机制提供理论参考.[方法]PCR扩增BoRACK1基因,构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GEP)的分布情况.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BoRACK1基因在不同组织中及在非生物胁迫(200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液)下幼苗中的表达情况.[结果]PCR扩增获得BoRACK1基因的开放阅读框(ORF)序列,其cDNA全长980 bp,编码326个氨基酸,氨基酸序列与其他植物的RACK1具有较高同源性,在65%以上,尤其与拟南芥的同源性高达93%.BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花和种子中均有表达,其中在根、叶和种子中的表达量较高,而在花、幼芽和茎的表达量较少.BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCl胁迫下的表达量整体上呈下调趋势,其中NaCl胁迫下其表达量在6 h时降至最低,而其他胁迫下其表达量均在4 h时降至最低.BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞质膜.[结论]BoRACK1基因表达无组织特异性,除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外,还可能参与了植物的抗逆性调控过程.     

大鲵泛素结合酶cgsUBE2L3基因克隆及其在免疫应答中的表达分析

[目的]研究泛素结合酶UBE2L3基因在大鲵免疫应答过程中的作用。[方法]克隆大鲵泛素结合酶基因(cgsUBE2L3),进行相关生物信息学分析,并通过qRT-PCR对其组织分布及免疫刺激下的表达谱进行分析。[结果]成功克隆了cgsUBE2L3基因,该基因全长包含一个462 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,预计蛋白分子量为21.2 ku;cgsUBE2L3氨基酸序列保守性很高,与非洲爪蟾的同源性高达97.4%;此外,qRT-PCR结果显示,cgsUBE2L3基因在大鲵组织中广泛分布,且被LPS感染的大鲵多个免疫组织中cgsUBE2L3的mRNA水平均发生了明显变化。[结论]cgsUBE2L3基因具有高度保守的结构特征,其组织分布具有特异性且参与大鲵抵抗LPS刺激的免疫应答。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.     

萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因的克隆与分析

[目的]对萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因进行克隆与分析。[方法]以萝芙木为材料,采用RACE技术,从萝芙木中克隆SGD的全长cDNA,并对其进行表达谱分析和相关生物信息学分析。[结果]萝芙木SGD基因cDNA全长1 856 bp,包含1 608 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸,预测分子量为61 kDa,等电点pI为6.16;生物信息学分析显示,RvSGD与蛇根木SGD及长春花SGD的序列相似性分别高达90.1%和70.9%,RvSGD也具有SGD蛋白的3个保守氨基酸催化位点His-161、Glu-207和Glu-419;荧光定量PCR表明,RvSGD在树皮中表达量最高,其次是老叶、根、嫩叶和茎。[结论]RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这个基因在TIAs的生物合成中的作用,并为今后调控TIAs的生物合成提供了新的靶点。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。