‘亚历山大’葡萄果实单萜生物合成相关基因转录及萜类物质积累规律

【目的】检测‘亚历山大’葡萄果实中萜类物质的种类和含量，分析果实发育过程中单萜类物质的积累与相关基因表达的关系，为揭示玫瑰香型葡萄香气物质的积累规律和香味育种奠定基础。【方法】从果实转色后至成熟期，每周取样一次，每次随机取样80—100粒，去籽去梗后榨汁，离心取上清液用于香气物质测定，使用顶空固相微萃取方法萃取样品中的挥发性成分，对采集到的质谱图用NIST 05谱库检索，并根据已有标样的色谱保留时间和保留指数，确定香气成分的化学组成，利用已有的化合物制备标准曲线进行定量。根据DXS的ORF序列设计引物，以充分成熟的样品RNA反转录获得的cDNA为模板，通过多次独立PCR扩增获得‘亚历山大’DXS的ORF片段，根据测序结果分析单核苷酸多态性位点。根据萜类生物合成途径中的8个关键酶基因序列设计引物，使用Ubiquitin，EF1-α和GAPDH 3个看家基因做为内参，进行实时定量PCR，检测这些基因的转录丰度。【结果】从转色后至成熟期，在检测到的所有单萜中里那醇和香叶醇的含量远高于其它单萜，多种萜类浓度逐渐上升，其中里那醇、月桂烯、柠檬烯上升6—8倍，香叶醇、萜品醇、香叶醛和萜品油烯上升2—3倍，玫瑰醚和橙花醛含量变化较小，果实中里那醇、香叶醇、氧化玫瑰和月桂烯的含量高于嗅闻阈值。在单萜生物合成早期途径中，DXS1的表达从转色开始缓慢上升，在花后15周迅速上调，上升约5倍。DXS3则从12周开始迅速上升。DXR表现出波动变化规律。HDR的表达量在前期合成酶基因中是最高的，能达到DXS1、DXS3、DXR的10—20倍；在合成途径中期的2个基因FPPS和GPPS，从转色后至成熟期表达量持续上调，FPPS的表达量上升了4倍，GPPS的表达量上升了2倍；在合成途径的后期，Liner-syn和Terp-syn在花后的11—15周都出现表达量升高，所有基因在花后17周出现明显的表达下降。单萜总量从花后12—16周迅速积累，这与同期DXS3、DXR、HDR、GPPS、FPPS的表达上调的趋势相一致。通过相关性分析结果显示萜类总量与DXS3的相关系数为0.831。‘亚历山大’DXS1的cDNA的开放阅读框全长2 151 bp，编码716个氨基酸，通过多次独立克隆后对测序结果进行比对，在该序列中发现了16个单核苷酸多态性位点，导致4个位置编码的氨基酸发生变化。【结论】单萜合成途径中多个关键酶基因后期表达上调，导致成熟过程中单萜化合物含量上升2—8倍，DXS3与单萜总量的积累具有显著的相关性。