褐飞虱GSK-3调控糖原与海藻糖代谢的潜在功能

【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3）调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱（Nilaparvata lugens）体内对糖原与海藻糖代谢的调控作用。【方法】首先,基于GSK-3的cDNA编码序列,利用ExPASy工具翻译GSK-3氨基酸序列,预测蛋白分子量大小及等电点（pI）;然后利用SignaIP4.1Server对其信号肽进行分析。其次,以笔者实验室饲养的褐飞虱为研究对象,从4龄开始,每12 h取材,取至成虫48 h。利用Trizol法提取褐飞虱总RNA,根据反转录试剂盒合成第一链DNA,以18S作为内参基因,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测褐飞虱GSK-3在不同龄期mRNA水平上的相对表达量。然后利用RNAi技术,向褐飞虱体内显微注射双链RNA(dsRNA)抑制GSK-3,以注射dsGFP的褐飞虱作为对照组。注射后48 h利用qRT-PCR技术检测GSK-3的表达情况,确定抑制效果。另外,取注射后48 h虫体,分别测定褐飞虱体内海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶（trehalase,TRE）活性变化。最后采用qRT-PCR检测胰岛素信号通路胰岛素受体基因(insulin receptor,InR)、类胰岛素多肽基因(insulin-like peptides,Ilps)及海藻糖代谢途径TRE、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶基因(glycogen synthase,GS)中相关基因的表达,分析GSK-3在胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径中的调控作用。【结果】褐飞虱GSK-3开放阅读框为1 914 bp,编码637个氨基酸;预测蛋白分子量为69.25 kD,等电点为9.15,为偏碱性蛋白,无信号肽结构,序列高度保守。发育表达模式结果显示GSK-3在不同发育阶段表达不一致,5龄若虫蜕皮前后低表达。GSK-3的dsRNA注射后48 h,与对照组dsGFP相比,GSK-3表达极显著下降,表明RNA干扰效果明显。糖原含量和两类海藻糖酶活性显著下降,而海藻糖含量显著上升,推测糖原和葡萄糖转化为海藻糖,作为其生理活动的能量来源。qRT-PCR检测发现,当GSK-3表达抑制后48 h,TRE1-2的表达量显著下降,而TRE1-1和TRE2的表达量极显著下降。另外,2个TPS基因、GS以及GP的表达量均极显著下降;胰岛素信号通路的2个InR基因和4个Ilps基因的表达同样被抑制,间接表明InR能够调控GSK-3的表达。【结论】褐飞虱GSK-3低表达后能够通过调控胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径相关基因表达来调控糖原及海藻糖代谢。相关研究结果有助于更加全面地探索褐飞虱等昆虫糖原合成酶激酶调控海藻糖及糖类物质平衡的潜在分子机理。     

加味丹参饮抑制p38MAPK表达保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞损伤的实验研究

目的 观察加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）乳鼠心肌细胞p38 MAPK蛋白表达的影响,以探讨其保护心肌的作用机制。方法 将20只SD乳鼠的心肌细胞进行原代培养,建立H/R模型并随机分为H/R组、SB203580（p38MAPK阻断剂组）、加味丹参饮含药血清组,正常心肌细胞组作为对照组。采用T淋巴细胞化学染色法鉴定心肌细胞,罗丹明B（Rhodamine B）染色法观察细胞形态,MTT比色法检测含药血清对乳鼠心肌细胞的毒性,Western-blot法检测MKK3（促分裂原活化蛋白激酶-激酶3）、MKK6（促分裂原活化蛋白激酶-激酶6）、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表达。结果 与正常血清对照组比较,H/R组MKK3、MKK6的蛋白表达增多,p38MAPK通路阻断剂SB203580和加味丹参饮均不能减少其表达;p38MAPK、phospho-p38MAPK在H/R时表达均增加（P<0.01）,而SB203580和加味丹参饮含药血清均能减少其表达（P<0.01）。结论 加味丹参饮含药血清预处理可通过抑制缺氧,复氧心肌细胞p38MAPK信号通路发挥保护作用,抑制p38MAPK表达及其磷酸化,减轻心肌细胞损伤,起到保护心肌细胞的作用。     

RNAi慢病毒表达对小鼠海马CA1神经元电生理功能的影响

采用立体定位注射方法使小鼠海马脑区CA1区域感染以U6为启动子表达EGFP(pU6-EGFP)的特异性感染神经元的RNA干扰(RNAi)慢病毒颗粒(pU6-EGFP),2~3周后在离体海马脑片上应用膜片钳与场电位记录方法研究CA1锥体神经元在电生理特性、突触传递以及突触可塑性方面的变化。结果表明:pU6-EGFP慢病毒注射后未对海马Schaffer collateral-CA1基本突触传递功能、突触可塑性功能、锥体神经元膜电位及放电特性(静息膜电位、动作电位阈值、可以诱发动作电位的阈电流)产生影响。说明pU6-EGFP慢病毒注射后对小鼠海马脑片细胞电生理功能没有产生影响,因此应用其脑内注射方法进行中枢神经系统功能学领域的研究是可行的。     

没食子酸对糖尿病小鼠的影响

试验探索了植物提取的没食子酸(GA)在胰岛素抵抗细胞培养模型中发挥的作用及对高果糖饮食(HFD)诱发糖尿病小鼠肝脏碳水化合物代谢的影响。GA可能通过抑制肝脏炎症来减轻胰岛素抵抗情况,从而使高血糖情况减轻,并通过增强肝糖原合成,抑制肝糖质新生来改善HFD诱发糖尿病的小鼠的肝脏碳水化合物代谢异常。在胰岛素抵抗的FL8313小鼠肝细胞中添加GA 6.25μg·m L~(-1),可使其吸收葡萄糖量增加19.2%。在口服葡萄糖耐受试验中,GA极大缓解了HFD诱导糖尿病小鼠的高血糖症状,减少了葡萄糖曲线下面积值,并降低内稳态模型中胰岛素抵抗指数。饲喂GA的HFD小鼠的血清果糖肽、果糖胺水平和心血管风险指数评分均显著降低。此外,GA促进HFD小鼠胰岛素上游信号分子表达,包括胰岛素受体、胰岛素受体底物1、磷脂酰肌醇-3激酶,Akt/蛋白激酶B和葡萄糖转运蛋白。抑制HFD小鼠体内糖质新生相关蛋白表达,例如果糖-1,6-二磷酸酶,而促进肝糖原合成酶表达和糖酵解相关蛋白表达,包括己糖激酶、磷酸果糖激酶和醛缩酶。研究结果表明,GA作为1种健康的食品成分,有一定的预防糖尿病作用。     

MAP激酶在植物信号传递网络中的功能

促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一.MAPK链由3类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成,通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子.本文主要阐述MAPK链在植物的逆境反应、抗病反应和激素调控等信号传递网络中的功能.     

FcγRIIb抑制B细胞内TLR4介导的CD40和CD80表达

利用磁珠法分选野生型和FcγRIIb缺陷小鼠脾脏CD19+B细胞,体外用LPS和/或FcγRIIb配体(IC)刺激24h后,流式细胞术(FCM)检测细胞表面共刺激分子的表达。用蛋白质印迹法检测IC刺激后B细胞内相关蛋白激酶的磷酸化情况。用Lyn抑制剂作用后,FCM检测LPS活化B细胞表面共刺激分子表达探讨B细胞内FcγRIIb对TLR4激动剂(LPS)诱导共刺激分子表达的影响。结果表明:IC抑制LPS活化B细胞表面CD40和CD80的表达,而在FcγRIIb缺陷小鼠B细胞内这一抑制作用消失。IC诱导B细胞内蛋白激酶Lyn的磷酸化,但不能诱导FcγRIIb缺陷小鼠B细胞内Lyn磷酸化。使用Lyn抑制剂后LPS活化B细胞表面CD40的表达上调。说明B细胞内FcγRIIb通过活化Lyn抑制TLR4激动剂诱导的CD40表达。     

坏死性凋亡及其相关疾病的研究进展

坏死性凋亡,即程序性坏死,主要由细胞因子(TNF-α、IFN-α、IFN-γ)、Toll样受体(TLR3、TLR4、TLR9)以及核酸(DNA、RNA)感受器等介导起始过程。受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和底物混合谱系激酶样蛋白(MLKL)参与坏死性凋亡的发生,MLKL是关键分子。目前研究发现,坏死性凋亡与感染性疾病、神经系统疾病、炎症、癌症的发生密切相关。本文将对细胞坏死性凋亡在炎性因子失衡中的作用、坏死性凋亡发生的分子机制、坏死性凋亡与多种疾病的关系以及治疗药物研究进展方面进行综述。     

mTOR抑制剂对胞内李斯特菌繁殖的影响

为了检测mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对单核细胞增生李斯特菌(Lm)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响,将不同浓度抑制剂雷帕霉素与细胞共同孵育,然后将Lm分别感染细胞,细菌菌落计数法计算胞内细菌数量,MTT法检测抑制剂雷帕霉素对细胞活性的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抑制剂雷帕霉素对Lm介导的IFN-γ和IL-6分泌的影响,利用试剂盒检测caspase-1活性。结果表明:抑制剂雷帕霉素在5、10、25 nmol/L浓度时不影响细胞活性,雷帕霉素显著抑制了Lm在细胞,且与雷帕霉素浓度和感染时间相关,雷帕霉素显著提高了Lm介导的IFN-γ、IL-6、caspase-1、IL-1β和NLRP3的mRNA水平。结论:本研究表明,mTOR抑制剂雷帕霉素可调控细胞内Lm的存活,雷帕霉素可增强Lm介导的细胞炎性体水平,为Lm引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。     

用根癌农杆菌离体转化大豆原生质体

以大豆 SB—8020,SB—8021,SB—43,SB—1等的愈伤组织为材料,用酶液制备原生质体,从 SB—8020中游离出大量原生质体,经培养可继续分裂,并获得愈伤组织,在 SB—18020原生质体培养中,加以四环素(终浓度为80mg/L)的选择压力,筛选出 SB—8020TRrP 细胞系统,经鉴定,该系统可在含四环素80mg/L 的培养基上生长。而在抗生素对野生型根癌农杆菌 B 3/73,C_(58),Ach_5,T_(37)的效应实验中,测得该浓度四环素对被测菌系均有明显抑菌作用。用 SB—8020TRrPⅡ与 T_(37)共培养,获得转化系统ⅩⅩⅤⅡ—5和ⅩⅡ—3,转化率为10~(-3)。经鉴定,这两个细胞系均能保持在无激素 MS 培养基上增殖,并含有胭脂碱。     

枯草芽孢杆菌突变株proBA基因植物表达载体的构建及转基因拟南芥的耐盐性能初探

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)抗脯氨酸结构类似物突变株中克隆得到脯氨酸合成途径中的关键酶基因proB(编码γ-谷氨酰胺激酶)和proA(编码谷氨酰胺-γ-半醛脱氢酶),同时设计引物从拟南芥基因组中扩增得到吡咯啉-5-羧酸合成酶B基因(p5csB)的第一个内含子序列,将其分别与proB和proA基因通过PCR拼接后,酶切连接构建得到植物双元表达载体pBI121pro.以LBA4404为介导,采用真空抽滤的方法转化得到转proBA基因拟南芥;第三代的纯合子(T3)通过半巢式PCR的方法验证外源基因已整合到拟南芥基因组中,GUS活性分析表明外源基因在叶片中表达最强,茎部其次,根部最弱;对600 mmol·L-1致死浓度NaCl耐受能力的分析表明,转基因拟南芥的平均存活时间(37.8 min)明显高于野生型拟南芥(26 min).     

赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究

为研究赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)诱导自噬的信号通路机制,通过药物的特异性抑制信号通路中不同激酶的活性,探讨特异性激酶抑制剂在OTA诱导的自噬及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)复制促进中的作用。结果表明:1)OTA能够抑制PCV2感染猪肾细胞株(PK-15)中的蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性,从而增强自噬能力;2)胰岛素能够逆转OTA引起的AKT与mTOR磷酸化水平的降低,能够逆反OTA诱导产生的自噬以及PCV2的复制促进;3)OTA能够激活细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号通路;4)ERK1/2的抑制剂(U0126)通过降低ERK1/2的磷酸化水平,从而抑制了OTA诱导的自噬及PCV2的复制促进;5)U0126能够减少OTA引起的mTOR磷酸化水平降低的幅度。     

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1 mRNA表达的影响

旨在研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-1( SBD-1) mRNA基因表达的影响及可能参与的信号通路,利用10~(-8) mol/L P4培养绵羊输卵管上皮细胞2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,利用RT-qPCR技术检测 SBD-1 mRNA的表达变化,选取P4诱导 SBD-1 mRNA表达的最佳时间。分别添加P4核受体阻断剂RU-486、蛋白激酶C (PKC)阻断剂H-7、蛋白激酶A (PKA)阻断剂H-89干预绵羊输卵管上皮细胞1h,再使用P4处理细胞。结果显示,用10~(-8)mol/L P4诱导绵羊输卵管上皮细胞6 h, SBD-1 mRNA表达显著升高;添加RU-486和H-89显著抑制P4诱导的 SBD-1 mRNA的表达;添加H-7后 SBD-1 mRNA的表达量无显著性差异。以上结果表明,P4诱导的绵羊输卵管上皮细胞中 SBD-1 mRNA的表达通过孕酮核受体(PR)和PKA信号通路介导,与PKC信号通路激活无关。     

阿米洛利对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制效应

蛋白激酶 CK2是一种多底物、多功能的信使非依赖性丝 /苏氨酸蛋白激酶。有研究表明 :在细胞增殖和肿瘤细胞中 CK2的活性增加 ,蛋白激酶 CK2的α和α′基因是癌基因。最近有学者指出 :CK2可能是肿瘤治疗的重要靶分子之一 ,其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值。阿米洛利 (amiloride)是上皮细胞钠通道抑制剂和钙离子通道的阻断剂 ,它抑制 Na+ /H+交换的 IC5 0 是 1μ mol/L左右 ,而抑制 Na+ - K+ ATPase的 IC5 0 则为 3mmol/L。研究表明 :它可抑制一些蛋白激酶如 型与 型 c AMP依赖的蛋白激酶(PKA,其 IC5 0 为 1mmol/L)、PK…     

芽孢杆菌固体菌剂对园林绿化废弃物堆肥的影响

【目的】研究2种自主研发的芽孢杆菌固体菌剂 B01、B02及其复合菌剂 (SB012)在园林绿化废弃物堆肥上的应用效果，为推广固体菌剂在园林绿化废弃物堆肥中的应用提供参考。【方法】以北京香山公园人工修剪或自然凋落的残体作为堆肥原材料，设置不添加菌剂的空白处理 (CK)以及添加芽孢杆菌固体菌剂B01、B02、SB012和市面上公认较优液体菌剂EM 共5个处理，其中固体复合菌剂SB012是将B01与B02按照质量比3∶1混合而成，加入菌剂后每日12:00测定1次堆体温度；每7 d采集1次样品，测定不同处理堆肥的pH、电导率(EC)、白菜种子发芽指数 (GI)和木质素、纤维素含量及其相对降解率以及腐殖酸、胡敏酸、富里酸含量与胡富比，分析B01、B02、SB012对堆肥进程的影响。【结果】随着发酵时间延长，不同处理的堆肥温度总体呈先上升后下降趋势。与CK处理相比，添加B01、B02、SB012和EM菌剂均能促进园林绿化废弃物堆体提前进入高温期，其中B01处理堆肥温度峰值最高，可达72.1 ℃；SB012处理次之，为70.2 ℃，均高于EM、CK处理。随着发酵时间延长，不同处理堆肥的pH总体呈升高趋势，EC呈先升高后降低趋势，直至堆肥结束(42 d)时，不同处理的pH均高于8.0,EC为0.76~1.04 mS/cm，均达到了国家对绿化植物废弃物的堆肥产品要求。随着发酵时间延长，不同处理白菜种子发芽指数(GI)总体呈先升高后降低趋势，其中堆肥结束时3种固体菌剂的GI依次为SB012>B01>B02，均高于EM和CK处理，且均满足对植物无毒害的标准 (GI≥85%)。5个处理中，SB012处理的木质素和纤维素相对降解率均最高，分别达到56.85%和79.84%，且显著高于EM和CK处理。【结论】SB012菌剂对园林绿化废弃物堆肥中纤维素、木质素的降解具有最好的促进效果，其堆肥产品具有品质好、安全性高等优点，可在园林绿化废弃物堆肥中推广应用。     

尼古丁降解菌的分离筛选及初步鉴定

分别采用基础平板培养法和富集培养法,从河南烟叶表面分离筛选尼古丁降解菌。结果表明:采用基础平板培养法分离出来的30个菌株中,有效菌株仅占所分离菌株的60.0%,对尼古丁降解效率大于30%的仅有6株菌(37℃,24 h)。而富集培养法分离出来的30个菌株中,有效菌株占所分离菌株的比例达93.3%,对尼古丁降解效率大于30%的有14株菌,表明富集培养法是一种快速高效分离筛选尼古丁降解菌的理想方法。经初步鉴定,分离到的2株具有较高活性的尼古丁降解菌分别为短芽孢杆菌(B.brevis)和侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)。     

信号转导抑制剂对囊素刺激杂交瘤细胞抗体分泌及其mRNA表达的影响

以杂交瘤细胞为模型 ,在培养液中加入不同的信号转导抑制剂和囊素 ,用间接ELISA法测定抗体分泌水平 ,用定量RT PCR法检测抗体mRNA的表达水平。结果表明 ,加入Gα 蛋白选择性抑制剂NF 0 2 3、蛋白激酶C抑制剂GF10 92 0 3X、磷脂酰肌醇 3激酶抑制剂heparin、Ca2 /calmodulin依赖蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN 6 2、磷脂酶C抑制剂U 7312 2和蛋白激酶G抑制剂后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响明显 (P <0 0 1)。而加入蛋白激酶A抑制剂 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、酪氨酸蛋白激酶抑制剂 genistein和丝裂原活化的蛋白激酶抑制剂PD 980 5 9后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响不明显 (P >0 0 5 ) ,这 3种抑制剂对杂交瘤细胞抗体分泌速度的抑制率分别为 74 5 5 % ,91 13%和80 6 9%。加入 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、genistein和PD 980 5 9后 ,囊素处理组与对照组γ1mRNA的表达水平差异不显著 (P >0 0 5 ) ,说明这 3种抑制剂阻断了囊素刺激的杂交瘤细胞抗体mRNA的表达。以上结果表明 ,蛋白激酶A、酪氨酸蛋白激酶和丝裂原活化的蛋白激酶参与了囊素在杂交瘤细胞中的信号转导。     

辐照红景天的抗疲劳作用研究

为研究~(60)Co-γ辐照处理红景天的抗疲劳作用,以30只体重为20～30 g的昆明种小鼠,随机分为6组:空白对照组(蒸馏水灌胃)、刺五加阳性对照组(300 mg/kg·bw)、辐照红景天提取物低(100 mg/kg·bw)、中(200 mg/kg·bw)、高(400 mg/kg·bw)剂量组、未辐照红景天提取物高(400 mg/kg·bw)剂量组,连续灌胃3周。灌胃结束后测定小鼠的爬杆和游泳时间,肝、肌糖原和血乳酸含量。与空白对照组相比,5个剂量组在延长爬杆和游泳时间,增加肝、肌糖原含量和降低血乳酸含量方面具有显著性差异(P0.05)。红景天经辐照处理后更明显地延长小鼠爬杆时间和游泳时间,并明显地增加小鼠的肝糖原、肌糖原含量,降低血乳酸含量,证明红景天经辐照处理后有显著的抗疲劳作用。     

小麦CBL结合蛋白激酶TaCIPK31负调控TcLr37对小麦叶锈菌的抗性

CIPK是植物特有的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族中的一类SnRK3激酶(SNF1-related protein kinase3),一般与类钙调磷酸酶亚基B类蛋白CBL(calcineurin B-like protein)相互作用形成信号网络,从而在钙信号介导的生理生化过程中发挥作用。克隆获得小麦中CIPK基因家族的TaCIPK31,其全长1 350 bp,编码449个氨基酸,包含保守的激酶催化结构域及调控结构域,与已报道的粗山羊草、水稻等CIPK蛋白具有高度相似性。定量分析结果表明,TaCIPK31在小麦-叶锈菌亲和反应中显著上调诱导表达。烟草亚细胞定位表明该基因分布于整个细胞。通过病毒诱导的基因沉默研究发现沉默TaCIPK31后小麦材料TcLr37对叶锈菌毒性小种THTT抗性增强。此外,详细的组织学分析表明,TaCIPK31沉默植株中推迟了病原菌在寄主中的定殖。推测TaCIPK31在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中起负调控作用,该结果对揭示CIPK蛋白激酶在小麦-叶锈菌互作体系的作用及分子机理提供参考。     

高粱理化诱变育种提高选择效率的研究

本试验用钴60γ射线,叠氮化钠1×10~(-3)M、5×10~(-3)M处理高粱晋粱五号,Tx623B等。结果表明:M_1的生理损伤效应和M_2突变频丰及突变谱有一定的关联性。苗期叶绿素突变频率随着M_1结实率的提高而增高,呈正相关。早熟突变频率随着M_1结实率的提高而降低呈负相关,结实率与其它类型突变率无关。     

多囊卵巢综合征与PI3K/Akt信号通路的关系

多囊卵巢综合症(PCOS)是女性常见的生殖功能障碍性疾病,主要表现为卵巢的雄激素过多及排卵障碍,是引起女性不排卵性不孕的主要原因。PCOS患者主要表现为胰岛素抵抗和高胰岛素血症,而PI3K/Akt信号通路是胰岛素发挥生理作用的主要信号通路,并且Akt的下游底物GSK-3是糖原合成的主要调控因子,本文就PI3K/Akt与胰岛素抵抗的关系做一综述,并对PCOS的治疗进行了展望。