Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

鸭甲型肝炎病毒1型3C基因的原核表达与多抗的制备

以血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3C基因为序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法进行扩增,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下重组蛋白并获得成功表达,该重组蛋白分子量约为38 ku,能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,经Western-blot分析证明,制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。3C基因在大肠杆菌中可获得成功表达,制备的多抗血清可用于3C蛋白的检测。     

鸭新城疫病毒NP基因的原核表达与多抗的制备

根据鸭新城疫病毒NP基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出NP基因,克隆入原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),在IPTG的诱导下融合蛋白获得了成功表达,SDSPAGE结果显示表达的融合蛋白分子量约为59kD,Western blotting分析表明该重组融合蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析显示制备的多抗血清能够与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,NP基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于NP蛋白的检测。     

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。     

猪源Mx1基因的原核表达及其抗血清制备

利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8 mmol.L-1 IPTG诱导后4 h,猪源Mx1基因(poMx1)在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99×103。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带。结论:poMx1基因表达成功。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α多克隆抗体的制备及应用

以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1 mmol/L IPTG在37℃诱导表达6 h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20 d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSV BJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)的主要结构蛋白VP1,根据GenBank已发表的DHAV-ⅠSH株VP1基因序列,设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP1,将其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定后,构建重组穿梭质粒rBacmid-VP1。在脂质体介导下将重组质粒rBacmid-VP1转染昆虫细胞Sf 9,制备含有DHAV-ⅠVP1基因的重组杆状病毒rBac-VP1。Western blot结果显示,表达的重组蛋白VP1大小约27 ku,能与DHAV-ⅠVP1多克隆抗体发生特异性反应;间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白VP1能与DHAV-Ⅰ全病毒阳性血清发生特异性反应,细胞内出现较强的荧光。以上结果表明,在昆虫细胞中成功表达了具有免疫原性的DHAV-Ⅰ主要结构蛋白VP1。     

塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64 000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。     

苹果茎沟病毒外壳蛋白抗体制备与应用

从苹果寄主上分离得到了苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)中国株系。经基因克隆,测序后发现苹果茎沟病毒中国株系外壳蛋白基因(coat protein,CP)含有714个核苷酸,编码表达由237氨基酸残基组成的27 ku蛋白。通过构建含有ASGV-CP基因的重组表达载体pECASGV-CP,在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达ASGV-CP蛋白。SDS-PAGE显示其分子质量与预计大小一致。利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体。该抗体可用于Western blot和DAS-ELISA检测技术。基于血清学检测,发现陕西苹果主产区ASGV发生普遍。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒（HCV）H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中，构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2，用重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒磷酸钙共沉淀法转染293T细胞,包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞仪技术（FACS）分析，结果表明,HCV E1E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠，经FACS分析免疫鼠血清，成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体，Western blot检测结果表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

东方粘虫中肠V-ATP酶a亚基的克隆及原核表达

对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。     

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒( foot and mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白，根据口蹄疫3D C端160个氨基酸序列，设计优化并人工合成相应的核酸序列，将其克隆至pET28a，构建原核表达质粒pET28a C160，并将重组质粒转化BL21(DE3)，0.5 mmol/L IPTG诱导后，收集菌液进行SDS PAGE和Western blot鉴定。结果显示，在25 ku处有一条明显的蛋白表达条带，且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析，结果显示，表达蛋白全部以包涵体形式存在，经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见：用纯化的3D C160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗，免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因疫苗的构建及其诱导小鼠体液免疫应答

将丙型肝炎病毒（HCV）H77株全长囊膜蛋白基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游，采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞，用流式细胞仪检测细胞瞬时表达的目的蛋白。将构建的重组质粒肌注BALB/c小鼠，用表达HCV囊膜蛋白的SP2/0细胞作为抗原，用流式细胞仪检测小鼠血清HCV囊膜蛋白抗体。再用原核系统表达的E2蛋白作为抗原,Western Blot检测免疫小鼠血清抗体。试验结果显示,囊膜蛋白E1E2在293T细胞膜上进行了瞬时表达，基因疫苗免疫小鼠后产生了抗HCV囊膜蛋白的抗体，该抗体能与表达HCV囊膜蛋白的SP2/0细胞特异性结合，Western Blot表明该抗体也能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。