树舌灵芝免疫调节蛋白基因克隆,生物信息学分析及真核表达载体构建

树舌灵芝(Ganoderma applanatum)为灵芝属内独特的一类,克隆树舌灵芝免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)基因,对其进行生物信息学分析并构建真核表达载体,将为高效表达重组树舌灵芝FIP和揭示其生物学功能奠定基础。采用染色体步移的方法从树舌灵芝菌丝体基因组DNA中扩增得到1个新型真菌免疫调节蛋白基因—FIP-gap,对其核苷酸序列进行生物信息学分析,结果表明,FIP-gap基因属于灵芝属FIP家族,含有342 bp,编码113个氨基酸。对其氨基酸序列分析表明:树舌灵芝免疫调节蛋白FIP-gap分子量为12.7 k D,理论等电点为4.93,富含丝氨酸,缬氨酸和苏氨酸,不含组氨酸和半胱氨酸。另外将FIP-gap与其他灵芝属FIP进行蛋白质序列比对分析,其具有FIP典型的保守序列,并与灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫灵芝(G.japoncium)、紫芝(G.sinensis)、小孢子灵芝(G.microsporum)和黑灵芝(G.atrum)具有78%、78%、78%、79%、78%和77%的同源性,为一新型的FIP。构建灵芝属真菌免疫调节蛋白系统进化树,结果表明树舌灵芝FIP-gap与其他灵芝属FIP均不聚类,说明其与其他灵芝属FIP的亲缘性相对较远。同时,构建了毕赤酵母重组表达载体p PIC9-FIP-gap,为进一步研究FIP-gap的生物学功能提供基础,为全面了解真菌免疫调节蛋白提供理论依据。     

重组真菌免疫调节蛋白对巨噬细胞RAW 264.7激活应答的研究

真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory proteins,FIPs)是一类从高等大型真菌中分离的、具有生物活性的小分子蛋白质。在之前的研究中,通过基因改组技术,对来自赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G.sinense)的FIP进行了重组改造,获得了具有333bp的FIP突变体FIP-SN15。本研究通过原核表达系统获得了重组FIP-SN15(rFIP-SN15),并利用荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术在转录水平上对rFIP-SN15诱导巨噬细胞TNF-α的功能及其机制进行研究。结果表明,rFIP-SN15在原核表达系统中的产量约为35.31mg/L;rFIP-SN15处理细胞后,TNF-α的转录水平显著上调(P0.05),并且Akt的转录水平上调极其显著(P0.01)。此外,ARG1和mTOR的mRNA水平上调显著(P0.05)。因此,rFIPSN15能够激活小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7。本研究为进一步验证FIP-SN15的生物学功能提供了有益的参考。     

云芝免疫调节蛋白基因克隆及酵母重组表达

真菌免疫调节蛋白(Fip)是真菌中重要的药理成分之一。为进一步开发真菌中Fip资源,从云芝中克隆了云芝免疫调节蛋白基因Fip-cve,对Fip-cve的理化性质和生物信息学进行了研究,并将其转入酵母表达载体中,成功获得了酵母转化子。结果表明:Fip-cve基因扩增片段长为336 bp,该序列编码111个氨基酸;Fip-cve蛋白的二级结构是以无规卷曲为主,同时含有35.71%的延伸链,还含有12.35%的α-螺旋,主要位于N端;疏水性分析表明该基因编码的蛋白是亲水性蛋白,二级结构分析也解释了该蛋白的结构特征;SDSPAGE电泳结果显示Fip-cve目的蛋白均在酵母中获得了高效表达,目的蛋白分子量约为13 ku;生物信息学分析结果表明,Fip-cve与灵芝属真菌免疫调节蛋白具有很高的同源性,特别是与小孢灵芝具有更高的同源性。该研究初步建立了Fip-cve的真核表达体系,以期为Fip-cve的进一步开发提供参考。     

黑眶蟾蜍皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与序列分析

[目的]克隆黑眶蟾蜍皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。[方法]从海南海口产黑眶蟾蜍皮肤中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建黑眶蟾蜍皮肤cDNA文库。根据已报道的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)序列,设计寡核苷酸引物用于筛选、克隆、测序。[结果]从所构建的cDNA文库中得到1个Serpin基因,命名为BmSP。对cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,该BmSP蛋白属于Serpin家族中SERPIN B亚家族,与鼠鳞状细胞癌抗原2(SCCA2)同源。该蛋白C末端含有一个RCL环(Reactive center loop regions)和一段高度保守的五肽。[结论]与SERPIN B亚家族中其他类型蛋白氨基酸序列比较结果表明,黑眶蟾蜍BmSP与SERPIN B亚家族中其他类型成员氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性,可能在其防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。     

辣椒小G蛋白CaRab11基因全长cDNA的分离及序列分析

通过分析克隆获得的辣椒Rab11全长cDNA及其编码的氨基酸序列结构特征,为进一步研究辣椒Rab11功能奠定基础.通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选分离获得了一个与葡萄Rab11小G蛋白VvRabAlf高度同源的全长cDNA,命名为CaRab11.序列分析结果表明:该cDNA包含有1164 bp的完整开放阅读框,编码217个氨基酸.该蛋白含有Rab GTP酶超家族保守的RabSF模体;Rab亚家族蛋白所特有的五个氨基酸序列RabF模体(RabF1-RabF5);参与GTP/Mg++结合及GTP水解的G结构域(G1-G5:GDSGVGKS,T,DTAGQE,GNKADL及ETSAL);两个构象变构域(Switch Ⅰ和SwitchⅡ)及与异戊二烯化相关的CCX序列.氨基酸同源性及进化分析同样表明CaRab11为辣椒小G蛋白Rab11家族新成员.     

草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达

[目的]分析草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达,为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考.[方法]通过生物信息学分析确定Vv-CNA基因的组成及保守结构,将ORF Finder预测的草菇CNA氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列进行比对,并通过荧光定量PCR检测Vv-CNA基因在草菇不同生长时期的相对表达量.[结果]Vv-CNA基因编码区为2503 bp,包含10个内含子(其中I2、I8、I9和I10存在内含子保留现象),编码610个氨基酸,GenBank登录号KX463514.将Vv-CNA氨基酸序列与动物(人、小鼠)、植物(拟南芥、水稻)和真菌(曲霉、酵母等)的CNA氨基酸序列进行同源比对分析,结果发现Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域,与密褐褶菌(Gloeophyllum trabeum)的亲缘关系最近.Vv-CNA基因在草菇子实体的蛋形期和伸长期高表达,以蛋形期的相对表达量最高.[结论]Vv-CNA基因编码钙调磷酸酶催化亚基,其高表达有利于草菇菌柄的伸长.     

灵芝属菌株的酯酶同工酶酶谱分析

对灵芝属中3株菌株(灵芝、紫芝和黑芝)进行了酯酶同工酶分析,垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明三种灵芝的酯酶活性有较大差别,其中除了紫芝和黑芝在Rf＝0.792处有一条共同的酶带外,三个菌株没有其它共同的酶带.     

灵芝转录因子同源蛋白生物信息学分析及转录表达特性研究

[目的]本文旨在对灵芝中主要的转录因子家族同源蛋白进行筛选,分析其序列特性和乙酸处理下的转录水平变化,为深入研究灵芝的基因表达及产物代谢调控提供理论基础.[方法]运用生物信息学方法,分析灵芝蛋白数据库,将其与公共数据库中的19种真菌常见转录因子家族进行比较,从中筛选出灵芝转录因子家族同源蛋白.对bZIP转录因子家族进行...     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝(Ganoderma lucidum)金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸(Ser)和丙氨基酸(Ala),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

灵芝属真菌线粒体基因组特征及进化

【目的】分析灵芝属（Ganoderma）真菌的线粒体基因组特征及进化,为灵芝属物种分类、分子进化和系统发育分析提供理论依据。【方法】基于灵芝属真菌15个线粒体基因组序列,利用MEGA X、MISA、mVISTA、MAFFT、DnaSP、PAML X和IQ-TREE等生物信息学软件对基因组特征、序列多态性、简单重复序列（SSR）、基因进化和系统发育进行分析。【结果】灵芝属真菌线粒体基因组全长为50603~124588 bp,GC含量为25.4%~27.3%,含有15个保守的蛋白编码基因（PCG）、2个rRNA基因和25~29个tRNA基因。SSR主要由AT构成,单核苷酸重复类型比例最高,其次为三核苷酸重复和四核苷酸重复。种间线粒体基因组序列差异较大,非编码区的变异水平高于编码区,nad6、nad3和cob基因编码序列的变异度较高,内含子长度与线粒体基因组大小呈显著正相关。15个保守的线粒体蛋白编码基因主要受纯化选择影响,其中cob、cox1和nad2基因含有正选择位点。基因编码偏好A/T含量高的密码子,27个高频密码子中,13个以A结尾,14个以T结尾。系统发育分析结果显示,灵芝属真菌主要分为2个聚类组,其中紫芝、狭长孢灵芝和G.wiiroense聚为一组;喜热灵芝、白肉灵芝和铁杉灵芝聚成一支,与树舌灵芝、梅氏灵芝、四川灵芝和亮盖灵芝构成姊妹类群,共同构成另一组。【结论】灵芝属真菌的线粒体基因组在进化过程中发生明显的遗传变异,基因组长度主要与内含子插入和删除有关,蛋白编码基因密码子使用偏性强。     

Cloning and Expression Profile of Deoxyhypusine Snyhtase Gene and Deoxyhypusine Hydroxylase Gene in Silkworm, Bombyx mori

Deoxyhypusine snyhtase （DHS） and deoxyhypusine hydroxylase （DOHH） are the two enzymes that catalyze the synthesis of hypusine within eukaryotic initiation factor 5A （eIF5A）. Synthesis of hypusine is essential for the function of eIF5A in eukaryotic cell proliferation and survival. Here we described the cloning and expression of two full-length cDNAs, encoding respectively DHS-like protein and DOHH-like protein from Bombyx mori by using the methods of bioinformatics, RACE, and RT-PCR technology, named as BmDHS and BmDOHH. Sequencing results indicate that they are 1 311 and 1 874 bp in length including complete open reading frame （ORF） 1 116 and 915 bp, which encode 371 amino acids （molecular weight is about 41.11 kD and isoelectric point is 5.84） and 304 amino acids （molecular weight is about 34.30 kD and isoelectric point is 4.86）, respectively. BmDHS contains only 1 exon, and BmDOHH contains 4 exons and 3 introns. The deduced amino acid sequence of BmDHS contains a deoxyhypusine synthase domain from 47 to 361 amino acid residues, and the deduced amino acid sequence of BmDOHH contains 6 E-Z type HEAT repeat domains （23-52, 54-83, 87-116, 177-206, 208-237, and 241- 270）. Compared to DHS and DOHH amino acid sequences from other species, such as Homo sapiens and Drosophila melanogaster, both silkworm DHS protein and DOHH protein have more than 55% identity. The conservative regions are very similar with each other. The phylogenetic tree analysis indicated that not only DHS but also DOHH from different species has genus-specific features. The expressions of BmDHS and BmDOHH are no tissue and stage specific in our tested samples.     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白（Ufml）的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufml基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减。DNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufml基因,经全长cDNA文库筛选获得ufml基因全长序列。【结果】Ufml基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9．3ku,等电点pI为6．55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufml基因存在较高的同源性。【结论】Ufml基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufml基因功能及原核表达等奠定了基础。     

小麦生育酚环化酶基因全长cDNA的克隆与分析

生育酚环化酶(TC)是维生素E生物合成途径中的关键酶。通过RACE-PCR得到了小麦生育酚环化酶基因的cDNA序列,该基因的cDNA全长1 769bp,包含一个长为1 404bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与水稻、玉米、芝麻、马铃薯、拟南芥的生育酚环化酶基因的一致率分别为91%、88%、71%、68%、67%。系统进化分析结果表明,不同植物来源的生育酚环化酶基因聚为3类。     

Gene product of v-fgr onc: hybrid protein containing a portion of actin and a tyrosine-specific protein kinase

The nucleotide sequence of the region of Gardner-Rasheed feline sarcoma virus (GR-FeSV) encoding its primary translation product, p70gag-fgr, has been determined. From the nucleotide sequence, the amino acid sequence of this transforming protein was deduced. Computer analysis indicates that a portion of P70gag-fgr has extensive amino acid sequence homology with actin, a eukaryotic cytoskeletal protein. A second region of P70gag-fgr is closely related to the tyrosine-specific kinase gene family. Thus, the v-fgr oncogene appears to have arisen as a result of recombinational events involving two distinct cellular genes, one coding for a structural protein and the other for a protein kinase.     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufm1基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufm1基因,经全长cDNA文库筛选获得Ufm1基因全长序列。【结果】Ufm1基因全长cDNA序列长714 bp,包含261 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9.3 ku,等电点pI为6.55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufm1基因存在较高的同源性。【结论】Ufm1基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufm1基因功能及原核表达等奠定了基础。     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1088bp,其中ORF771bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1 088 bp,其中ORF 771 bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80 kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

绵羊痘病毒甘肃流行株膜蛋白ORF23基因的克隆及序列分析

从甘肃景泰县疑似患羊痘的绵羊皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增膜蛋白ORF23基因.序列分析表明,该基因由1113个核苷酸组成,编码370个氨基酸,A+T含量占69.90%,G+C含量仅占30.10%.绵羊痘病毒甘肃株ORF23基因与A株、NISKHI株之间的核苷酸同源性分别为99.6%和99.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.4%;与皮肤疙瘩病病毒NW-LW株和山羊痘病毒Pellor株之间的核苷酸同源性均为98.2%.结构预测显示,ORF23膜蛋白为非分泌蛋白,具有一个O连结糖基化位点.可见,ORF23膜蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断研究价值.