编码棉花胞质铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与表达分析

 【目的】克隆编码棉花胞质铜锌超氧化物岐化酶基因并分析其表达特性。【方法】采用 RACE 技术克隆基因，Northern blotting 检测基因的表达谱；采用氮蓝四唑（NBT）光下还原法测定不同生育期的酶活性。【结果】获得了棉花胞质铜锌超氧化物岐化酶基因cDNA 全长序列（GenBank 注册号：DQ445093）；该基因cDNA全长共682 bp，开放阅读框456 bp，编码152个氨基酸。分子结构预测结果：酶蛋白理论分子量约为15.03 kD，理论等电点为6.09，与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在82%～87%之间。Southern blotting显示不同棉种该基因的拷贝数基本一致，均属于低拷贝基因。Northern blotting显示该基因在不同的组织、不同的生育期表达量不同；酶活性测定显示盛花期最高。【结论】棉花胞质铜锌超氧化物岐化酶基因在陆地棉中属于低拷贝数基因；在整个生育期中mRNA的含量呈规律性动态变化，前期较低，后期较高，在盛花期达到顶峰；变化曲线与不同时期的酶活性变化一致；不同器官的基因表达检测结果显示：基因在根中表达量最高，叶片次之，花中的表达最低。     

甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因,并分析其序列特征、组织特异性表达及在不同逆境胁迫下的表达模式。【方法】以甘蔗桂糖28号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得Cu/Zn-SOD,采用生物信息学方法分析所推测的氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR研究Cu/Zn-SOD在不同组织及逆境条件下的表达情况。【结果】克隆获得甘蔗Cu/Zn-SOD,NCBI登录号为JQ958328,其开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,与禾本科植物聚于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明Cu/Zn-SOD在根、茎、叶中均有表达,为组成型表达,在叶中表达量最高;Cu/Zn-SOD在聚乙二醇（PEG）、NaCl、低温（4℃）和H2O2四种非生物胁迫下均诱导表达,表达模式因调控机制的不同而异。【结论】克隆获得Cu/Zn-SOD,其主要在甘蔗绿色组织中表达,其在铜/锌SOD超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高,可能与甘蔗抵御渗透胁迫相关。     

植物Cu,Zn-SOD分子调控机理研究进展

铜/锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)能清除植物体内有害的活性氧(ROS),参与植株遭受逆境胁迫时的应激反应等过程。铜分子伴侣(CCS)可以传递铜离子到Cu,Zn-SOD当中,并将其激活生成有活性的酶分子,依赖CCS协助是Cu,Zn-SOD主要的激活途径。植物在铜缺乏的环境下会诱导启动子结合蛋白(SPL7)和小RNA398(miR398)的表达,miR398通过降解编码Cu,Zn-SOD的mRNA抑制Cu,Zn-SOD的生成,从而调控植物体内铜平衡。本文主要对植物Cu,Zn-SOD激活和调控途径进行综述。     

外源SOD对棉花光合性能及抗逆性的影响

以人工合成超氧物歧化酶(SOD)为材料,研究外源SOD(Cu.Zn-SOD,Mn-SOD)对棉花光合性能和抗病性的影响。试验结果表明,与Cu.Zn-SOD(10 mmol/L),Mn-SOD(5 mmol/L,10 mmol/L)相比,Cu.Zn-SOD(5 mmol/L)播前浸种可以减轻棉花苗期病害发生率,盛花期叶面喷施可以有效减轻光合午睡,吐絮期喷施可以减缓叶绿素降解速度。所有处理对棉叶光合速率和生育前期叶绿素含量以及棉花枯、黄萎病发病均没有影响。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建及其表达研究

【目的】为解决医用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)来源的限制,利用基因工程方法构建牦牛Cu,Zn-SOD原核表达系统,为重组牦牛Cu,Zn-SOD作为注射用药奠定基础。【方法】RT-PCR扩增牦牛Cu,Zn-SOD编码基因,构建Cu,Zn-SOD/pET22b(+)重组表达载体,并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、活性染色及邻苯三酚法进行检测,采用BradFord方法测定融合蛋白浓度。【结果】本试验成功获得了牦牛Cu,Zn-SOD cDNA,长456bp,编码152个氨基酸。与普通牛SOD编码基因序列cDNA一致率为99.6%,氨基酸序列一致率为98.7%,表达产物分子质量约为32kD。酶粗提取液比活约为35U·mg-1。重组蛋白浓度0.2772(mg·mL-1)。【结论】本研究成功构建了牦牛Cu,Zn-SOD/pET22b(+)原核表达载体,表达量较高、稳定性强,重组表达产物具有较高生物学活性。     

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶（ Cu/Zn-SOD）基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明：双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5′端非编码区,261 bp 3′端非翻译区和453 bp 开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2＋和Zn2＋结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD 蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15249900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

不同来源的超氧化物歧化酶部分理化性质比较研究

对4种不同来源的超氧化物歧化酶的部分理化性质进行了比较研究。结果表明:牛血Cu,Zn-SOD和rhCu,Zn-SOD对一些化学试剂的敏感性方面基本相似,rhCu,Zn-SOD的热稳定性最好,80℃水浴60 min后活力仍有56%;在pH 5.0～11.0的范围内,Cu,Zn-SOD的活力比较稳定,Mn-SOD在pH 5.0以下容易失活,在碱性条件下较稳定。螺旋藻Fe-SOD和rhMn-SOD热、酸碱的稳定性较低;Cu,Zn-SOD、Fe-SOD和rhMn-SOD对一些化学试剂和不同变性剂的敏感性有明显的差别。rhMn-SOD稳定性,对化学试剂的敏感性方面与天然原料来源的Mn-SOD基本一致。Cu,Zn-SOD和Mn-SOD、Fe-SOD相比较,理化性质有明显的差别。     

仁用杏叶不同生育时期主要保护酶活性的变化规律

[目的]研究仁用杏的抗逆性机理。[方法]以5年生发育良好的仁用杏苗木的叶片为试验材料,于硬化期、生长初期和速生期对仁用杏苗木进行铜、锌喷雾处理,采用NBT还原法和邻苯二酚法分别对仁用杏叶片的多酚氧化酶(PPO)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定,分析了仁用杏叶中主要保护酶PPO和SOD的酶活性在不同生育时期的变化规律。[结果]仁用杏叶经Cu(3)Zn(0)处理后PPO活性显著提高,且在硬化期也保持较高的水平。仁用杏叶经Cu(0)Zn(3)处理后PPO活性的增强很小甚至表现负作用。仁用杏叶经过Cu(0)Zn(3)处理后SOD的活性有显著提高,生长初期的SOD活性明显高于硬化期和速生期。[结论]锌对仁用杏叶内SOD的活性的增强作用比较显著,铜、锌通过PPO和SOD的活性的改变影响仁用杏苗木生长,从而提高苗木抗逆性。     

牛乳中超氧化物歧化酶(SOD)的提纯与鉴定

新鲜牛乳经超速离心,氯仿乙醇处理,丙酮沉淀、透析、ＤＥＡＥ纤维素柱层析等步骤使其中Ｃｕ－ＺｎＳＯＤ得到了纯化,提纯后酶的比活为１４９．５Ｖ／ｍｇ。该酶对Ｈ２Ｏ２敏感,并且在２７２ｎｍ和６７５ｎｍ处各有一吸收峰,证明被纯化的酶是Ｃｕ－ＺｎＳＯＤ。     

陆地棉与海岛棉抗氧保护酶差异的比较

选用7份陆地棉、4份海岛棉为试材,比较了陆地棉和海岛棉不同发育阶段的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的变化差异性。结果表明,海岛棉和陆地棉的SOD有不同的变化规律;评价SOD关键时期是花铃期以后。陆地棉的CAT活性不同材料有不同规律,评价关键期和材料直接相关;4份海岛棉材料的CAT有一致的变化规律,均在7月20日出现高峰,建议评价关键期为始花期;海岛棉和陆地棉的POD活性表现略有差异,评价陆地棉和海岛棉关键期为吐絮期。通过对抗氧保护酶活性的研究从而为海岛棉改良陆地棉提供参考。     

杨梅超氧化物歧化酶SOD2同源基因片段的克隆及序列分析

根据植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的保守区设计特异性引物,通过RT-PCR技术,克隆杨梅叶超氧化物歧化酶保守区之间的cDNA序列.该序列长233 bp,编码一段由77个氨基酸残基组成的SOD保守区片段,该肽段具有Cu/Zn SOD的特征序列.序列同源性分析表明,该序列与Genba...     

膜下滴灌条件下水氮供应对棉花根系及叶片衰老特性的调节

【目的】探讨膜下滴灌条件下,水氮运筹对棉花产量形成期根系及叶片衰老特性、产量和水分利用效率的调节效应,为调控滴灌棉花早衰和提高棉花产量提供依据。【方法】在土柱栽培条件下,采用膜下滴灌技术控制水氮的供应量及分配比例,共设置4个水分、2个氮肥运筹共8个处理,研究水氮供应方式对膜下滴灌棉花根系生长、根系活力、根系及叶片保护性酶活性、产量和水分利用效率的影响。【结果】与其它水氮供应方式相比,播前灌条件下盛花期前限量滴灌后恢复充分滴灌配合重施花铃肥的水氮供应方式显著促进了棉花深层根系生长、增强了根系活力,根系及叶片SOD活性较高、MDA含量较低,延缓了植株衰老进程,提高光合产物向生殖器官分配的比例、增加铃重,从而获得了较高的产量和水分利用效率。【结论】播前灌溉条件下,适当减少盛花前水氮供应、增加生育中后期水氮的分配比例是提高膜下滴灌棉花产量和水分利用效率的有效水氮运筹方式。     

Undetectable intracellular free copper: the requirement of a copper chaperone for superoxide dismutase

The copper chaperone for the superoxide dismutase (CCS) gene is necessary for expression of an active, copper-bound form of superoxide dismutase (SOD1) in vivo in spite of the high affinity of SOD1 for copper (dissociation constant = 6 fM) and the high intracellular concentrations of both SOD1 (10 microM in yeast) and copper (70 microM in yeast). In vitro studies demonstrated that purified Cu(I)-yCCS protein is sufficient for direct copper activation of apo-ySOD1 but is necessary only when the concentration of free copper ions ([Cu]free) is strictly limited. Moreover, the physiological requirement for yCCS in vivo was readily bypassed by elevated copper concentrations and abrogation of intracellular copper-scavenging systems such as the metallothioneins. This metallochaperone protein activates the target enzyme through direct insertion of the copper cofactor and apparently functions to protect the metal ion from binding to intracellular copper scavengers. These results indicate that intracellular [Cu]free is limited to less than one free copper ion per cell and suggest that a pool of free copper ions is not used in physiological activation of metalloenzymes.     

华北落叶松体内超氧化物歧化酶初探

以三年生华北落叶松苗为材料,用铜锌处理,对其体内超氧化物歧化酶活性年变化进行了分析探讨,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对其体内超氧化物歧化酶同工酶进行了分析,结果表明:树液流动期SOD酶活性最高,随气温的回升其活性逐渐降低。SOD酶与三年生华北落叶松苗木抗逆性密切相关,苗木经铜锌互作后SOD酶活性明显高于对照,锌通过间接作用促进铜对SOD酶的作用,从而提高铜锌互作效应。单独用锌处理在叶组织可以合成新的SOD同工酶蛋白,铜锌元素还可以增加原有同工酶的活性。     

Functional role of caspase-1 and caspase-3 in an ALS transgenic mouse model

Mutations in the copper/zinc superoxide dismutase (SOD1) gene produce an animal model of familial amyotrophic lateral sclerosis (ALS), a fatal neurodegenerative disorder. To test a new therapeutic strategy for ALS, we examined the effect of caspase inhibition in transgenic mice expressing mutant human SOD1 with a substitution of glycine to alanine in position 93 (mSOD1(G93A)). Intracerebroventricular administration of zVAD-fmk, a broad caspase inhibitor, delays disease onset and mortality. Moreover, zVAD-fmk inhibits caspase-1 activity as well as caspase-1 and caspase-3 mRNA up-regulation, providing evidence for a non-cell-autonomous pathway regulating caspase expression. Caspases play an instrumental role in neurodegeneration in transgenic mSOD1(G93A) mice, which suggests that caspase inhibition may have a protective role in ALS.     

新疆棉田根际土壤真菌荧光PCR技术定量及其时空动态分析

【目的】研究新疆棉花黄萎病病株根际土壤真菌数量的时空动态变化,及棉花根际土壤真菌与黄萎病病原菌数量的相关性。【方法】用荧光定量PCR方法,测定新疆不同植棉区及其不同生育时期棉田根际土壤真菌总量和棉花黄萎病病原菌数量进行测定,分析棉花黄萎病病株根际土壤真菌数量在不同植棉区和不同生育时期的变化趋势,及棉花根际土壤真菌与棉花黄萎病病原菌数量的相关性。【结果】新疆不同植棉区的棉花在不同生育期其病株根际土壤真菌数量表现出不同变化趋势。哈密棉花病株吐絮期根际土壤真菌最大值达 6.16×10⁴ copies/g FRW;库尔勒棉花病株根际土壤真菌在苗期达到最大为4.23×10⁴ copies/g FRW;阿拉尔棉花病株根际土壤真菌在苗期至蕾期逐渐增加,随后逐渐减小,在吐絮期达到最小值为1.41×10^-4copies/g FRW。北疆精河和东疆哈密棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量的PCC分别高达0.989和0.993,呈显著正相关。南疆图木舒克棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量的PCC为0.880,呈正相关。【结论】新疆棉花黄萎病病株根际土壤真菌含量较高,在不同采样区和不同生育期,其根际土壤真菌总量均呈波动性变化。从棉花的四个生育期(苗期、蕾期、花铃期、吐絮期)来看,棉花病株根际土壤真菌数量最大值出现在吐絮期。新疆棉花病株根际土壤真菌数量的空间变化是东疆大于南疆大于北疆。在不同生态区,棉花根际土壤真菌和棉花黄萎病病原菌之间表现为正相关,而在不同发育期则表现为负相关。     

铜、锌离子对凯特杏膜脂过氧化及抗氧化酶活性的影响

对不同铜、锌处理下凯特杏体内的丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性的动态变化进行测定,结果表明：铜离子不利于凯特杏细胞膜的稳定,而锌离子有利于凯特杏细胞膜的稳定。     

纯化黑加仑种子中超氧化物歧化酶(SOD)的研究

采用有机溶剂分级沉淀法、纤维素离子交换层析法及葡聚糖凝胶过滤法从黑加仑种子中提取SOD。实验证明 :粗酶液经上述方法纯化后SOD酶活性达692.95U,蛋白含量为0.72mg,比活达964540U·g-1,纯化倍数达253.16 ,回收率为31.41%。黑加仑种子中的SOD是Cu.Zn-SOD     

Control Efficacy of Broccoli Residues on Cotton Verticillium Wilt and Its Effect on Soil Bacterial Community at Different Growth Stages

【Objective】The objective of this study is to research the effects of broccoli residues (BR) on cotton verticillium wilt and soil bacterial community structure at different growth stages, and to provide new ways and ideas for green ecological control of cotton verticillium wilt and reduction of chemical pesticides.【Method】In the field plot experiment, the soil planted with cotton was treated with broccoli residues and no broccoli residues (CK). The incidence dynamics of cotton verticillium wilt in different treatments were monitored at different growth stages. The number of DNA copies of Verticillium dahliae was determined by real-time quantitative PCR, and the structure of soil bacterial communities was measured by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq). The effects of broccoli residues returning to soil on the quantity of pathogen and the community of soil bacteria were analyzed. Principal component analysis (PCA) was used to explore the characteristics and rules of structural changes of soil bacterial community at the level of phylum and genus in different growth stages.【Result】The incidence and disease index of cotton verticillium wilt showed a downward trend after the return of broccoli residues to soil, respectively. Moreover, the peak period of verticillium wilt was delayed, and 70.77% control efficacy was achieved at the peak period. The development curve of disease index and time course of disease in the whole growth period was established, and the average control efficacy was 57.21%. Compared to the blank control, the number of DNA copies of V. dahliae was decreased by 10.96%, 11.11%, 25.95% and 11.25% at the 4 stages of cotton growing and non-growing season, respectively, after the return of broccoli residues to soil. Illumina MiSeq analysis showed that broccoli residues treatment significantly increased soil bacterial diversity. The richness index Chao1 was increased significantly at all growth stages, and the ACE index was significantly increased at the pre-sowing stage, flowering and boll stage and boll-opening stage. Compared to the blank control, the relative abundance of Actinobacteria was increased significantly at different growth stages after the return of broccoli residues to soil. Meanwhile, the results showed that there were differences in the composition of dominant microorganisms at different growth stages after the return of broccoli residues to soil. For example, Firmicutes increased to the dominant microflora at the pre-sowing stage and seedling stage, and Cyanobacteria became the dominant microflora at the bud stage and flowering and boll stage. Principal component analysis showed that broccoli residues to soil changed the structure of bacterial community at seedling stage, bud stage, flowering and boll stage and boll-opening stage. Further analysis showed that the relative abundance of Streptomyces and Bacillus was significantly increased after the return of broccoli residues to soil.【Conclusion】Broccoli residues returning to soil can effectively inhibit the occurrence of cotton verticillium wilt, reduce the number of DNA copies of V. dahliae in soil, change the structure of soil bacterial community, and increase the relative abundance of beneficial microorganisms, which is an effective green measure to control cotton verticillium wilt.