云南火焰兰转录组SSR分布及其序列特征分析

[目的]分析云南火焰兰转录组中SSR分布及其序列分布特征,为大量开发EST-SSR引物及开展火焰兰属乃至兰科植物的SSR遗传多样性分析、种质资源评价、遗传图谱构建及遗传育种提供理论依据.[方法]以云南火焰兰无菌苗幼嫩叶片为材料,利用高通量测序技术进行转录组测序,使用Trinity对测序结果进行de novo组装,并以MISA对获得的Unigene进行SSR位点搜索,然后利用Excel 2010对云南火焰兰转录组中SSR出现频率、平均分布距离、基元类型及其重复类型组成等进行统计分析.[结果]从77888条去冗余的Unigenes序列中搜索到5051个SSR位点,其中有414个属于复合型SSR位点,实际以4637个SSR位点进行分析,SSR出现频率为5.95%,平均分布距离13.53 kb.SSR位点中,二核苷酸为主要重复基元类型,数量最多,占SSR总数的52.21%,其次是三核苷酸重复基元,占39.42%,四核苷酸重复基元~六核苷酸重复基元数量较少.其中,二核苷酸重复基元中的主要重复类型为CT/GA,占SSR总数的20.64%,三核苷酸重复基元的主要重复类型为CTT/GAA,占SSR总数的4.70%.SSR基元各重复类型的重复次数以5~8次居多,占SSR总数的73.35%,其中,占比最多的是6次重复,占SSR总数的26.98%,其次是5次和7次,分别占SSR总数的23.08%和14.02%,且SSR数量随各基元重复次数的增加而降低.云南火焰兰转录组中SSR基序的平均长度是18.28 bp,其中大小为12~20 bp的SSR基序占SSR总数的77.49%,21~30 bp基序占SSR总数的17.88%,大于30 bp的基序占SSR总数的4.63%,且SSR分布频率随基序长度的增加而下降.[结论]云南火焰兰转录组SSR中低级基元类型较丰富,开发出多态性高的SSR引物潜力较高,可用于云南火焰兰乃至火焰兰属植物的遗传多样性及种质资源评价、遗传图谱构建及遗传育种等研究.     

怀菊转录组中SSR位点信息分析

以转录组测序数据为基础,利用MISA软件对简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)进行检测及分析,分析怀菊转录组中的SSR位点信息,并设计SSR引物,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测等提供参考。结果表明,共检测到8 553个SSR位点,它们分布在7 369条Unigene中,出现频率为2.83%,SSR位点的发生频率为2.44%;其中单核苷酸重复基序最多、其次为三核苷酸重复基序。怀菊转录组基序长度主要集中于12～19 bp,多具有中等多态性。对SSR序列设计引物,共得到25 662对引物可供今后使用。总之,怀菊SSR位点类型丰富,具有良好的多态性潜力及可开发性。     

辣木转录组SSR位点信息分析

采用MISA对15 824条长度大于1kb的辣木Unigene进行SSR位点分布频率和基本特征的分析,共检测到8 272个SSR位点,分布于6 003条Unigene,SSR位点出现频率为52.28%,共包含114种重复单元。辣木转录组的SSR以单核苷酸重复为主,占总SSR的55.69%。其次是二、三核苷酸重复,分别占总SSR的32.34%和11.24%。A/T、AG/CT和AAG/CTT是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸中的优势重复基元。辣木转录组SSR以10~20次重复为主,基序长度主要集中于12~19bp。结果表明辣木转录组中含有大量SSR,且类型丰富,可为辣木SSR引物开发提供候选序列。     

苦荞转录组EST-SSR发掘及多态性分析

利用Misa软件对苦荞种子转录组高通量测序获得的45 699条EST序列进行了SSR位点扫描,共得到2 700个SSR位点,分布于2 624条EST序列中,SSR位点平均距离为1/1.73 kb。随着EST序列长度的增加,含SSR位点序列的比例也随之升高,800 bp以上EST序列含SSR的比例明显高于800 bp以下序列。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复是苦荞EST-SSR主导类型,分别占总SSR的52.11%、13.33%和30.63%,其中(A)n、(AG)n和(AAG)n是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基序,分别占总SSR的51.85%、7.11%和8.93%。设计合成了150对 EST-SSR 引物,其中91对引物（60.67%）在40份苦荞种质中获得有效扩增,30对引物（32.97%）具有多态性。平均每对引物能检测到3.53个等位变异;多态信息含量（PIC）在 0.10~0.71之间,平均达0.40。以上结果说明,从苦荞转录组EST序列中大规模开发SSR标记是一条简便而可行的途径。     

基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发

通过对棉花转录组进行测序获得的57 695条Unigenes,利用MISA软件进行搜索,得出简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)的分布情况,共挖掘检索得到1 886个SSR位点,SSR的出现频率为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上,发生频率为3.05%,平均每20.8 kb会出现1个SSR位点。有117条Unigenes含有1个以上SSR位点,含有复合型SSR的Unigenes数目为56条,其中三核苷酸基元类型分布最多,SSR数量为1 582个,占挖掘出总SSR数量的83.88%,而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小。最后通过Primer 3程序进行SSR引物设计,得到部分引物序列,可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。     

基于RNA-seq数据的小麦条锈菌SSR标记开发

为开发小麦条锈菌基因组编码区内多态性高的SSR标记,应用MISA软件从4个小麦条锈菌分离物转录组测序数据中搜索SSR位点并设计相应引物。结果表明,在小麦条锈菌转录组2 941条unigenes中发现6 083个SSR位点,SSR发生频率为14.13%,平均每9.84 kb出现1个SSR位点。获得的SSR有144种重复基序,单核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占SSR总数的42.33%和39.90%。T和AAC、ATC、CAT分别是单核苷酸和三核苷酸的优势重复基序。转录组中SSR重复次数以5~12次为主,基序长度主要集中在12~20 bp。随机合成100对SSR引物对3个小麦条锈菌分离物基因组DNA进行PCR扩增,有87对引物可以扩增出条带。总之,这些基于转录组发掘的SSR位点出现频率高、类型丰富,在小麦条锈菌群体遗传结构研究、分子标记开发等方面具有一定的应用潜力。     

基于高通量测序的北柴胡根转录组SSR位点信息分析

以北柴胡根为试材,采用高通量转录组测序方法,获得uingene序列信息,研究分析SSR分布、基元特征,设计、验证EST-SSR引物的有效性,为开发、丰富EST-SSR分子标记奠定基础。结果表明：从北柴胡根转录组中共筛选到31 176个SSR位点,分布于21 732条unigenes,出现的频率为20.08%,分布密度为3.20个/10 kb,主要重复基元类型以二核苷酸最为丰富,共21 056个,占SSR位点总数的67.54%;其次是单核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR的19.05%和12.07%;四核苷酸～六核苷酸重复基元数量均较少。不同核苷酸基序类型共有131种基元,重复基元次数在5～11次的数量最多,占SSR总数的91.7%,且长度基本小于15 bp,其中AT/AT和AC/GT这两种基元在二核苷酸中出现频率最高。2 064条和1 004条含有SSR位点的unigenes分别注释到GO和KEGG通路,获得注释的基因功能主要与基础代谢相关。从22 090对具有潜在多态性的EST-SSR引物中,随机挑选20对引物对3个北柴胡种质DNA进行PCR扩增,扩增成功率最高达85%。北柴胡根转录组S...     

四倍体野生种花生A.monticola全基因组SSR的开发与特征分析

【目的】通过对四倍体野生种花生Arachis monticola（AABB,2n = 4x = 40）全基因组SSR位点搜索,研究其全基因组SSR分布特征及规律,开发并验证其全基因组SSR引物,为花生属植物遗传进化分析及重要性状分子标记开发提供依据。【方法】在华大基因GigaScience数据库下载A.monticola全基因组序列,并利用生物信息学软件MISA进行SSR位点搜索,Primer 3进行引物设计,通过电子PCR进行单位点SSR分析,并随机合成100对SSR引物验证通用性。【结果】SSR在四倍体野生种花生A.monticola基因组上共搜索到SSR位点676 878个,平均每3.8 kb就会出现一个SSR,分布于5 127条scaffold中,单核苷酸至六核苷酸均有分布,且数量上差异较大,以单碱基、二碱基、三碱基为主,三者占SSR总数的94.28%,其中单碱基重复数量最多,占46.71％,密度最高;六核苷酸重复数目最少,分布最稀疏。大多数SSR分布在基因间区,基因区SSR多分布于内含子区域;全基因组共鉴定出395个不同的重复基元,其中A亚基因组342种,B亚基因组356种;A/T是最丰富的重复基元;在1—6个核苷酸的重复基元中,数量最多的依次是A/T、AT/AT、AAT/ATT,AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT、AAAAAT/ATTTTT;整体来看,重复基元的重复次数多集中在50次以内,不同类型的motif的重复次数差异很大;同一种类型重复基元的SSR位点,随着motif重复次数增加,SSR的数量逐渐降低;B03染色体上SSR数量最多,A08染色体中SSR密度最高。A.monticola全基因组SSR比A.duranensis、A.ipaensis基因组SSR数量多,密度也更高,A.monticola单核苷酸重复最丰富,2个野生种二核苷酸数量最多。共设计出SSR引物192 303对,单位点SSR标记检出率50.35%,单点SSR标记在基因组上的分布呈现两端密集,中间稀疏的特点;随机合成的100对引物中,90对能在A. monticola中扩增出稳定清晰的条带,且在4份不同的花生基因组DNA中扩增目的条带表现出不同的特点。【结论】A.monticola基因组内SSR种类和数量丰富,单核苷酸至六核苷酸均有分布,单核苷酸重复基元数量最多,且最密,六核苷酸重复基元数量最少,出现频率最低,不同重复基元频数高低与核苷酸数量没有严格相关性,SSR多分布在基因间区,基因区内含子区域SSR数量最多;A.monticola A、B亚基因组具有其各自特异的重复基元类型;单个类型重复基元数量最多的均为AT富集的重复基元,而GC富集的重复基元相对较少;同一种类型重复基元的SSR位点,随着motif重复次数增加,SSR的数量逐渐降低;A.monticola全基因组SSR较2个二倍体野生种数量更多,密度也更高且重复基元分布规律不同;经过初步验证,开发的SSR引物在4份花生材料中表现出部分通用性。     

玉米丝黑穗病菌基因组SSR信息分析及其引物设计

探讨玉米丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)基因组序列中SSR位点的分布与组成特点,为开发可用于玉米丝黑穗病菌遗传多样性分析的Genomic-SSR标记奠定基础。从NCBI公共数据库下载玉米丝黑穗病菌的23条染色体基因组序列,利用SSRIT在线软件对第4、5、6、7条染色体进行SSR位点的搜索,并且利用Primer 3.0软件设计Genomic-SSR引物。结果表明:在玉米丝黑穗病菌基因组序列的第4、5、6、7条染色体中,共搜索到317个SSR位点,平均每条染色体出现79个SSR位点,其总长度为6.89kb,占这四条染色体基因组总长的0.21%,大约每10.3kb中就有一个大于18bp的SSR序列。其中,主要的重复类型是三核苷酸重复单元,占全部SSR的53.94%(171个),其次为二核苷酸重复单元,占全部SSR的16.09%(51个)。数量最少的是六碱基重复单元,为17个(5.36%)。出现频率最高的的重复基序为(GCA/TGC)n(13.25%),其次是(AGC/GCT)n和(CAG/CTG)n,出现频率分别为8.52%、8.20%。并在此基础上,利用Primer3.0在线软件设计了40对SSR引物。玉米丝黑穗病菌基因组序列中SSR位点丰富,具有发掘玉米丝黑穗病菌SSR标记的潜力。