生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化*

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S.scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌.该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuziginea Poll.)等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用,有良好的生防应用潜力.为了对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中一些功能基因进行研究,得到高产抗生素的工程菌株,首先应对该菌的遗传转化条件进行优化.作者分别以基因整合型质粒pSET152和基因破坏型质pKC1139为出发质粒,ET12567(PUZ8002,pSET152/pKC1139)为供体,Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,选取MS、PDA、TSB琼脂培养基、燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验.结果表明MS培养基为接合转移的最适培养基,经验证,已成功地将质粒pSET152/pKC1139转入到了Men-myco-93-63中.以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10 min,37℃温育2.5 h,转化效率是10-7～10-6.以菌丝体为受体时,转化效率是10-7～10-6,但菌丝培养过程中容易出现污染.另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16～18 h覆盖效果最好.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中3个调控基因的检测

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63及其发酵液对多种重要植物病原菌均表现出很强的抑制作用,在植物病害生物防治方面有很大的应用潜力。根据天蓝色链霉菌A3(2)调控基因tcrA、sarA和scrX序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,分别获得705bp、1 472bp和473bp的片段,经测序和比对,上述片段与天蓝色链霉菌A3(2)的tcrA、sarA和scrX基因在核苷酸序列和氨基酸序列上同源性均为99%,因此,推测玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中很可能含有这些调控基因。Men-myco-93-63中这3个调控基因的初步检测为玫瑰黄链霉菌功能基因的获得、菌株的遗传改良和代谢调控途径的研究提供了重要依据。     

玫瑰黄链霉菌活性代谢产物诱导烟草灰霉病抗性机制研究

【目的】解析温室条件下玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物Roflamycoin和Men-myco-A（简称R&M）诱导烟草灰霉病抗性的作用机制,为利用R&M绿色防控烟草灰霉病提供理论依据。【方法】通过80 mg/L R&M注射4~5叶期本生烟草叶片后过敏反应（HR）染色验证及100 mg/L R&M注...     

玫瑰黄链霉菌抗药性标记及其定殖和促生作用研究

选用腐霉利、多菌灵、甲基托布津、利福平、青霉素、链霉素、泰乐菌素、重铬酸钾等8种常用抗生素或杀菌剂,通过抗药性标记试验,建立了玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63的抗药性标记,确定了重铬酸钾(0.06g/L)/青霉素(0.2g/L)为适合检测该菌株的标记药剂及浓度。通过获得的抗药性标记,结合菌落形态观察和16SrDNA序列分析,研究了Men-myco-93-63在番茄根际土壤中的定殖动态和对植株生长的影响。结果表明,该生防菌在番茄根际土壤中能够定殖,接菌15d后定殖量达到最高,为5.6×105 cfu/g,之后下降,到30d后检测不到Men-myco-93-63菌株的存在。当使用Men-myco-93-63的固体发酵物与土壤以体积比1∶400混合时,对番茄苗期生长有促进作用。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成 和再生条件的初探

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在温室及大田试验中都对棉花黄萎病菌表现出很强的拮抗作用,是一株很有应用潜力的生防菌株。不论是菌丝体本身还是其代谢产物都对多种植物病原菌有很强的抑制作用。对该生防菌株进行深入研究,尤其是分子水平的研究尤为重要。笔者通过研究影响链霉菌原生质体形成的多种条件和因素,包括培养基的选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等,最终成功的制备出了生防菌Men-myco-93-63的原生质体,初步确定了其形成条件:TSB培养基一级培养24h,用SGGP作为二级培养基培养菌丝体40h(补加甘氨酸2%),将菌丝体加入2mg/ml溶菌酶37℃水浴60min后即可得到原生质体,涂在再生培养基R5上再生培养,再生数可达4.8×106个/ml。为该生防菌原生质体的转化、基因表达等研究奠定了重要的基础。     

淡紫拟青霉PL04菌株抗逆性及其对香蕉根结线虫的寄生作用

抗逆性测定结果表明,淡紫拟青霉PL04菌株有较强的抗逆性和对化学农药的兼容性.PL04菌株在PSA培养基上菌落生长和产孢的适温为5～40℃ (最适温度为29℃). PL04菌株在pH4～13(最适pH为7)范围内的培养基上均可生长;PL04菌株在40℃和50℃条件下的LT50分别为78.8 min和40.8 min.PL04菌株有较强的耐盐碱能力;PL04菌株对氯霉素有较强的耐受性;PL04菌株对杀菌剂多菌灵、百菌清、苯醚甲环唑、除草剂百草枯以及消毒防腐剂福尔马林较敏感,其EC50分别为0.021、0.013、0.006、0.016和0.120 mg/mL,PL04菌株对杀线虫剂阿维菌素和辛硫磷,杀菌剂三唑酮不敏感,其EC50分别为0.175 、0.338和0.337 mg/mL.采用双温测定法,室内测定淡紫拟青霉PL04菌株对香蕉根结线虫的寄生作用,不同处理具有显著性差异,PL04菌株孢子悬浮液处理18 d后对香蕉根结线虫卵的相对寄生率为94.3%.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdA_(mgh)基因的验证

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)等多种重要的植物病原真菌都具有较强的抑制作用。nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是从天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物,PCR扩增出Men-myco-93-63nsdAmgh基因,经斑点杂交法验证,nsdAmgh确实在该生防菌中存在。该基因的发现有助于进一步了解该生防菌产生抗生素调节的分子机制,也为抗生素高产菌株的获得提供了新的靶标。     

苍耳愈伤组织提取物对番茄灰霉病菌的抑菌活性

以野外采集苍耳和室外种植苍耳提取物为对照,利用生长速率法、孢子萌发法及显微观察,研究了苍耳愈伤组织提取物对番茄灰霉菌活性的影响。结果表明:苍耳愈伤组织提取物对番茄灰霉菌具有较强的抑制作用,其抑制菌丝生长的EC50为20.27 mg/mL,在30 mg/mL浓度下,对番茄灰霉菌孢子形成和孢子萌发的抑制率均达到70%以上,其对孢子形成和孢子萌发的EC50分别为9.06 mg/mL和15.21 mg/mL,其抑菌活性与野外采集苍耳和室外种植苍耳抑菌提取物相当.     

海南大棚西瓜枯萎病病原菌生物学特性及室内毒力测定

对供试菌株海南大棚西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型进行了生物学特性的研究及杀菌剂室内毒力测定。生物学测定结果表明:菌丝在西瓜汁培养基上生长最好;菌丝生长和孢子萌发的最适温度分别为28和30℃;菌丝生长和孢子萌发最适pH值分别为7～8和7～9;光暗交替有利于菌丝生长;孢子致死温度为60℃、5 min;果糖和葡萄糖作为碳源利于菌丝生长;酵母浸粉和蛋白胨作为氮源利于菌丝生长。室内毒力测定结果表明:50%咪鲜胺锰盐WP对西瓜枯萎病菌的抑菌效果最好,其EC50为0.730 9μg/mL;32.5%苯甲嘧菌酯SC、30%苯甲.丙环唑EC、10%苯醚甲环唑WG、25%溴菌.多菌灵WP和25%溴菌腈WP对海南大棚西瓜枯萎病菌也有较好的抑制效果,其EC50为1.884 7～8.161 0μg/mL,该研究为田间防治海南大棚西瓜枯萎病提供了基础数据。     

苗菌敌对茄子黄萎病菌的室内毒力测定

采用生长速率法测定结果表明:杀菌剂苗菌敌对茄黄萎病菌(Verticillium albo-atrum Reinke et Beinth)的4个分离菌株的菌丝生长具有较强的抑制作用。在药剂含量为0.001～0.500 mg/mL的PDA培养基上接菌72 h后,兰州枯死菌株菌丝生长的相对抑菌率为28.91 %～100 %,毒力回归式为Y=2.372 7+1.304 7x,EC50=0.010 32 mg/mL;兰州普通型菌株菌丝生长的相对抑制率为20.14 %～100 %,毒力回归式为Y=2.095 14+1.401 6x,EC50=0.011 82 mg/mL;天水分离菌株菌丝生长的相对抑制率为19.30 %～100 %,毒力回归式为Y=1.909 9+1.498 9x,EC50=0.011 52 mg/mL;白银分离菌株菌丝生长的相对抑制率为33.36 %～100 %,毒力回归式为Y=2.453 6+1.324x,EC50=0.008 364 mg/mL。相关分析表明,以上几种分离菌株的x值与Y值相关关系显著。用改良的涂布平板法测定,苗菌敌对茄黄萎病菌孢子萌发有明显的抑制作用,病菌孢子在浓度为0.001～0.500 mg/mL药液中处理48 h后,兰州枯死菌株、普通菌株、天水菌株、白银菌株的孢子萌发相对抑制率分别为0.45 %～86.08 %、2.23 %～91.10 %、1.20 %～91.38 %、0.78 %～93.37 %。4菌株初生菌丝生长的速度均随药液浓度的增大而降低,菌丝出现畸形扭曲,不能正常生长发育,影响分生孢子梗的分化。     

四脊裸胞壳Dh菌株液体培养条件下淀粉酶的产生及活性影响因子

对虫生真菌四脊裸胞壳(Emericella quadriclineata)Dh菌株产淀粉酶的条件及理化特性进行了研究.在孢子浓度为1.5×106个/mL的PD培养液中恒温(25±1)℃振荡(120 r/min)培养3.5 d,菌丝生物量最大达5.1 mg/mL,产淀粉酶量达272.42 U/mg;培养液初始pH4~6最有利淀粉酶的产生,产酶量为1 377.20~1 528.99 U/mg菌丝.淀粉酶活性在50℃,pH 6.0条件下最高.在pH4~7范围内20℃下处理20 min或在pH4~7范围内37℃下处理1 h酶活较为稳定,保持在65%以上.40℃下处理20 min酶活保持90%以上.60℃和70℃下处理20 min,酶活保持在50%以下.在70℃下处理80 min,剩余酶活仅为11.70%.一定浓度的Cu2+和Ba2+有利于酶活提高;同时Mg2+,Fe2+,Ca2+,NH4+对酶活性的抑制作用依次增强.     

淡紫拟青霉E7菌株抗逆性研究

对淡紫拟青霉E7菌株的耐热性、耐酸碱性、耐盐性及耐化学药物特性进行测定。结果显示,在PSA培养基上,E7菌落生长和产孢的适宜温度为5～40℃,最适温度为29℃;E7菌株在pH4—13范围内的培养基上均可以生长;在40℃和50％条件下E7菌株的LT50分别为78．8和40．8min;E7菌株有较强的耐盐碱能力,对氯霉素有较强的耐受性;E7菌株对杀菌剂多菌灵、百菌清、苯醚甲环唑、除草剂百草枯以及消毒防腐剂福尔马林较敏感,其EC50分别为21、13、6、16、120μg／mL,对杀线虫剂阿维菌素和辛硫磷、杀菌剂三唑酮不敏感,其EC50分别为175、338、337μg／mL。表明淡紫拟青霉E7菌株有较强的抗逆性,对一些化学农药的兼容性也较好。     

一株木霉菌(Trichoderma sp.)TY2纤维素酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

[目的]筛选高活力纤维素酶产生菌,高效利用纤维素资源.[方法]从朽木和和纸浆样品中分离筛选出一株产纤维素酶活较高的菌株TY2.对其形态和18S rDNA特征序列分析鉴定为木霉菌(Trichoderma sp.).对菌株发酵条件及酶学特性进行研究.[结果] TY2菌株的最佳产酶条件为:1;滤纸+2;麸皮+0.5;葡萄糖为碳源,0.5;蛋白胨为氮源,起始pH 5.0,温度28 ℃,200 r/min,5 d,其CMCase和FPase活力分别达412.5 和100.3 U/mL.经分离纯化出TY2菌株内切β-葡聚糖苷酶.内切β-葡聚糖苷酶最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为4.6,在50 ℃以下,pH 3.0～5.0,酶活性稳定,且在80 ℃仍具有降解CMC-Na的效果.同时研究发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对内切β-葡聚糖苷酶的酶活有促进作用,而汞离子有明显的抑制作用.[结论]所筛选的TY2菌株具有潜在的工业应用价值.     

碱性脂肪酶产生菌的发酵条件及酶学性质研究

研究1株碱性脂肪酶产生菌L198发酵条件及酶学性质.结果表明,产酶发酵培养基为(;):豆饼粉1.0,玉米浆1.0,葡萄糖1.0,K2HPO4 0.5,NaNO3 0.5.500 mL三角瓶装液50 mL,30℃,180 r/min摇床培养40 h.酶学性质研究:最适反应温度为40℃,最适pH 9.0;在pH 8～10稳定.其热稳定性较好,在20～40℃放置6 h后仍可以保持较好酶活力.金属离子Na+、 K+对酶活有显著激活作用,而Cu2+对酶活有显著抑制作用,而K+、Mg2+、Fe+对酶活有抑制作用.     

大肠菌群快速检测纸片配方与工艺研究

将大肠菌液制成已知准确浓度的模拟菌液作为试验样品,通过对影响自制大肠菌群快速纸片效果的配方和工艺参数进行研究。筛选出纸片配方为：乳糖2.5g、蛋白胨1.5g、胆盐0.15g、TTC（4%）2mL、琼脂0.1g、NaCl0.3g、K2HPO34g、溴甲酚紫2mg、乳化剂S（1%）2mL、pH6.8～7.0;筛选出工艺参数为：灭菌温度110℃、灭菌时间15min、浸液时间1min、浸液温度60℃、烘干温度55℃。通过重复性和准确性试验,证明自制纸片和发酵法检测的结果总符合率为94%,经统计学处理P〉0.05,说明两法的检测结果无显著区别。     

5-吲哚甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析

通过RP-HPLC同时检测酶水解反应前后底物5-吲哚甲基海因及产物D-氨甲酰-N-色氨酸的含量变化,不仅可以检测海因酶的活性,还能分析酶反应过程的转化效率。采用Merck公司的PurospherSTARRP-C18e色谱柱(4.6mm×250.0mm,5μm),以乙腈-20mmoL/L磷酸二氢钾缓冲液(体积比25∶75)为流动相,磷酸调pH值为3.0,流速为1.0mL/min,柱温为30℃,检测波长为220nm,于10min内很好地实现了各组分的分离。采用外标法进行定量分析,D-色氨酸、5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的线性范围分别是0.10～1.00mg/mL(r=0.9991)、0.20～2.00mg/mL(r=0.9989)、0.20～2.00mg/mL(r=0.9989);酶反应体系中5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的加标回收率分别为99.3%～100.2%和98.0%～99.3%,精密度分别为0.51%～0.87%和0.43%～0.94%。试验结果表明该法快速简便、准确可靠。     

粗糙脉孢菌GH45家族内切纤维素酶基因ncGH45在毕赤酵母中表达及重组酶的性质表征

纤维素酶作为一种重要的糖苷水解酶,在生物质能源生产、饲料、造纸、洗涤和纺织领域都有着非常广泛的应用。粗糙脉孢菌来源的GH45家族内切纤维素酶基因(nc GH45)全长935 bp,包含一个53 bp的内含子(339-391),编码272个氨基酸,包括一个N-端的GH45家族催化结构域和C-端的1家族碳水化合物结合结构域。该基因在毕赤酵母中得到了分泌表达,且表达蛋白条带单一,酶活性达到20 U/m L。重组酶r Nc GH45的最适p H为4.5~5.0,最适温度为60~65℃,并且在较宽的p H范围(p H 4.0~8.0)和温度范围(30~70℃)都能维持75%以上的酶活。在37℃和50℃,p H 3.0~11.0都有着非常好的稳定性;该酶的热稳定性非常好,在70℃和80℃处理2 h还能剩余89.6%和77.7%的酶活,即使在沸水中煮10 min还能剩余10%的酶活。r Nc GH45的最适底物是地衣多糖(1 116.0 U/mg),其次是大麦葡聚糖(754.2 U/mg)和CMC-Na(254.6 U/mg),对大麦葡聚糖和CMC-Na的动力学常数Km和Vmax分别为6.26 mg/m L和997.4μmol/mg·min,19.96 mg/m L和722.1μmol/mg·min。水解产物分析结果表明,r Nc GH45对多糖的水解产物主要是纤维五糖,对寡糖的最小作用底物是纤维三糖,而对纤维二糖没有作用。对纺织品脱毛实验的结果表明,酶的添加量为10 U时,减量率为1.55%。上述结果表明成功构建了r Nc GH45高效表达工程菌株,表达的重组蛋白性质优越,有着良好的工业应用前景。     

溶菌酶产生菌的筛选及产酶条件研究

为了从微生物中获取溶菌酶,本研究采用双层平板法从土壤中筛选获得一株产溶菌酶活性较高的菌株S2-6b.利用摇瓶发酵优化产酶条件,液体发酵培养基成分为可溶性淀粉15%,牛肉膏25%,玉米浆05%,NaCl 05%,起始pH值为70,培养温度为28 ℃,接种量为30%,摇瓶的装液量为40 mL/300 mL,转速为200 r...     

新疆阿勒泰和温泉县冷水鱼肠道产低温蛋白酶菌株的筛选及其酶学性质的研究

[目的]从50株冷水鱼肠道产蛋白酶菌株中筛选优良产酶菌株,并研究其酶学性质,为高效低温蛋白酶技术的研发奠定基础。[方法]对比脱脂乳平板初筛结果确定供试菌株,对选定菌株进行表型及16S rRNA/26S rRNA序列同源性分析,确定产酶菌株的进化地位。用Folin酚显色法复筛,并研究最佳产酶菌株所产蛋白酶的酶学性质。[结果]从6株供试菌株中筛选出一株高产酶菌株P-D-10,初步鉴定隶属于Pseudomonas。酶学性质的初步研究显示,P-D-10产生的蛋白酶最适反应pH在8.5左右;在0～60℃均有催化活性;具有10和40℃2个最适酶活温度;热稳定性较差,在70℃水浴10 min后剩余酶活力仅为20.14%。除了Tween-80对该酶酶活力有促进作用外,其他金属离子、还原剂、表面活性剂和金属离子螯合剂对该酶酶活力均有不同程度的抑制作用。[结论]筛选获得的高产酶菌株P-D-10隶属于Pseudomonas,是一株具有研究与应用潜力的产低温蛋白酶菌株。