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【目的】桃小食心虫(Carposina sasakii)是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关键氨基酸位点,为揭示桃小食心虫嗅觉的分子机理提供理论依据。【方法】通过原核表达系统获得CsasCSP16蛋白,并使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白。采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-pheny-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,从33种寄主挥发物和2种性信息素分子中筛选出与CsasCSP16结合亲和性高的配体分子。通过对CsasCSP16进行同源建模获得其三维结构模型,以CSPMbraA6(PDB ID:1N8U)为模板成功构建CsasCSP16的三维结构模型。使用Autodock Vina软件将CsasCSP16与亲和性高的配体分子进行对接,构建蛋白-配体复合物。然后使用GROMACS(2019.3)软件对复合物进行动力学模拟,从动力学模拟的平衡状态中选取100个构象,使用g_mmpbsa软件计算CsasCSP16与气味分子的结合能,并通过能量分解的方法预测关键氨基酸残基。【结果】成功构建了CsasCSP16的克隆表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统获得高纯度的重组蛋白。与35种配体分子的荧光竞争结合表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯有较强的结合活性,其Ki值分别为6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L-1。分子对接的结果表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯的Vina Score值分别为-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。动力学模拟结果表明,CsasCSP16与气味分子复合物在50 ns内达到平衡状态,通过g_mmpbsa计算复合物的结合能,CsasCSP16-水杨酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的结合自由能分别为-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol-1;最后,通过分解每个氨基酸贡献的结合自由能表明异亮氨酸49(Ile49)、缬氨酸71(Val71)、异亮氨酸72(Ile72)和酪氨酸90(Tyr90)贡献的结合能>3 kJ·mol-1,因此推测这4种氨基酸在CsasCSP16结合气味分子的过程中发挥关键作用。【结论】桃小食心虫CsasCSP16能与寄主植物的多种气味分子结合,推测其可能在桃小食心虫对寄主植物的定位过程中发挥重要作用。异亮氨酸49(Ile49)、缬氨酸71(Val71)、异亮氨酸72(Ile72)和酪氨酸90(Tyr90)可能是CsasCSP16与配体分子结合的关键氨基酸位点。 相似文献
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【目的】通过研究铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)气味结合蛋白11(odorant binding protein 11,OBP11)与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。【方法】设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP11,分析其序列特征并与相似序列进行对比;将目的基因OBP11连入原核表达载体pET28a后,重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达,超声破碎菌体,取上清液过镍柱,利用重组肠激酶切除His标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白;纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验,测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性;利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模,以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48(PDB ID:4ij7)作为模板,获得其三维结构;利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接,模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。【结果】克隆获得了AcorOBP11全长基因,开放阅读框共639 bp,N末端有17个氨基酸组成的信号肽,具有8个保守的半胱氨酸位点,属于Plus-C OBP亚家族,进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。AcorOBP11成功连入pET28a表达载体,在0.25 mmol·L-1 IPTG、37℃条件下诱导表达,并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明,AcorOBP11结合谱较广,对α-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。其中,与寄主植物挥发物α-紫罗兰酮结合能力最好,竞争解离常数为22.78 μmol·L-1。构建了AcorOBP11三维结构图并进行蛋白构象评估后,与6种化合物进行分子对接,结果表明AcorOBP11与α-紫罗兰酮结合自由能最低,为-24.74 kJ·mol-1,表明其与α-紫罗兰酮的结合能力最强,与荧光竞争结合结果一致;从对接图还可以看出,α-紫罗兰酮不仅与AcorOBP11在Cys163处形成氢键,而且其疏水端进入了蛋白的疏水腔,两个甲基与蛋白表面高度契合,因此,α-紫罗兰酮与蛋白间结合能力最强。【结论】AcorOBP11能够识别多种寄主植物挥发物,推测其在铜绿丽金龟成虫定位寄主植物中发挥重要作用,此研究结果为生态防控铜绿丽金龟提供了新思路。 相似文献
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云南切梢小蠹气味结合蛋白的分子对接 总被引:1,自引:0,他引:1
为研究云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)参与其嗅觉识别过程的机理,基于气味结合蛋白、绿叶挥发性物质的三维结构,采用分子对接方法对云南切梢小蠹OBP与3个绿叶挥发性物质可能的结合方式和结合能力进行模拟,结果表明,(E)-2-己烯醇较其他2个小分子而言更容易与云南切梢小蠹OBP结合,形成稳定的氢键。(E)-2-己烯醇与Tyun OBP2结合能最低,更容易与Tyun OBP2结合,Tyun OBP2与小分子物质的结合,可能通过占有该蛋白与寄主气味结合的空间或者通过改变Tyun OBP2三维结构,导致Tyun OBP2难以识别寄主松树散发的气味。 相似文献
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【目的】 沙葱萤叶甲(Galeruca daurica)是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp(GenBank登录号MK250532),其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框(ORF)全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L -1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L -1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L -1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。 相似文献
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中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析 总被引:6,自引:4,他引:2
【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔,4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中,且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力,且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。 相似文献
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为了更好地了解昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在桔小实蝇Bactrocera dorsalis嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性,本研究克隆了一个"Minus-C"OBP基因Bdor OBP1a。BdorOBP1a基因长480 bp,编码159个氨基酸,其N端含有26个氨基酸的信号肽,去信号肽氨基酸序列中有4个保守的半胱氨酸。利用荧光竞争结合实验对Bdor OBP1a与21种寄主挥发物进行结合特征的测定,结果表明Bdor OBP1a可以与15种寄主挥发物结合,其中结合能力最强的是β-紫罗兰酮和苯甲醛,解离常数分别为31.1、31.8μmol/L。行为反应表明桔小实蝇对β-紫罗兰酮,乙酸异戊酯,苯甲醛和己酸乙酯都具有趋性。由此推断,Bdor OBP1a具有选择性识别和结合各种配基的特性,并在桔小实蝇对寄主植物气味的定位过程中起着重要的作用。 相似文献
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【目的】探讨芒果壮铗普瘿蚊为害对芒果叶片挥发物的影响,为瘿蚊防治提供参考依据。【方法】采用顶空固相微萃取(SPME)及气质联用仪(GC-MS)技术分析芒果壮铗普瘿蚊为害后芒果叶片挥发性物质和相对含量的变化。【结果】健康叶片和虫伤叶分别含有65种和66种挥发物成分,其中45个组分相同,主要包括石竹烯、α-荜澄茄烯、十八碳烯、蒈烯、水芹烯、β-月桂烯、蒎烯等。瘿蚊为害后挥发物主要为萜烯类31种和芳香族化合物13种,相对含量分别高达51.41%和41.10%,酯类物质相对含量明显高于健康叶片,成分也发生改变。虫伤叶挥发物除了萘和薁之外,主要物质包括甲基-4-(1-甲基亚乙基)-环己烯(24.32%)、α-荜澄茄烯(8.92)、3-蒈烯(2.23%)、乙酸酯3-己烯-1-醇(2.23%)、4-蒈烯(1.06%)、柠檬烯(1.04%)、a-石竹烯(1.46%)。极微量物质包括辛醇、兰桉醇、斯巴醇、表蓝桉醇、长香茅醇,香豆素类化合物只在健康叶片中检测到,马兜铃烯、法呢烯和一些特殊萘和薁芳香族化合物只在虫伤叶中检测到。【结论】芒果叶片的主要挥发性物质为芳香族类和萜烯类化合物,瘿蚊为害后导致挥发物质和含量发生明显改变。 相似文献
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[目的]预测烟夜蛾(Helicoverpa assulta)的气味结合蛋白。[方法]用同源模建的方法构建烟夜蛾(Helicoverpa assulta)气味结合蛋白的三维结构,并用Procheck、Verify_3D、Errat、ProSa2003等程序进行评价。[结果]程序评价结果表明模建结构是可靠的。模建结构显示烟夜蛾的气味结合蛋白由6个α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,底物结合口袋成锥形;6个保守的半胱氨酸形成3个对结构起稳定作用的二硫键。[结论]预测结构可靠,为烟夜蛾的研究及虫害的防治提供了理论依据。 相似文献
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[目的]预测蔷薇科斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)信息素结合蛋白的三维结构。[方法]用同源模建的方法构建蔷薇科斜条卷叶蛾信息素结合蛋白的三维结构,并分别用Procheck、Verify_3D、Errat、ProSa2003等程序对模建结构的可靠性进行评价。[结果]模建结构显示蔷薇科斜条卷叶蛾的信息素结合蛋白由6个α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,底物结合口袋成锥形的特征,6个保守的半胱氨酸形成3个对结构起稳定作用的二硫键。[结论]预测结构可靠,为蔷薇科斜条卷叶蛾的研究及虫害的防治奠定了理论基础。 相似文献
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陕北黄土区不同植被类型土壤有机碳分布特征及其影响因素 总被引:2,自引:0,他引:2
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