石斛菌根菌复合菌剂的研制及应用

选用木霉菌(Trichoderma)的F35菌株、石斛小菇(Mycena dendrobii Fan et Guo)的F48菌株和石斛生长需要的营养元素,研制出石斛菌根菌复合菌剂,并确定了石斛菌根菌复合菌剂的保存期及最适用量。金钗石斛组培苗的移栽结果表明,经石斛菌根菌复合菌剂处理的金钗石斛组培苗干重比对照提高29.03%,比单一菌剂提高8.11%～17.65%;石斛多糖含量比对照提高85.29%,比单一菌剂提高14.55%～50.00%;总生物碱的含量比对照提高16.30%,比单一菌剂提高4.90%～11.46%。     

10株镰刀菌rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析

[目的]探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。[方法]采用氯化苄法从分离的10株镰刀菌菌株中提取基因组DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。采用Blast方法将测序结果在GenBank中进行同源搜索,采用邻接法构建其与相关菌株的ITS序列系统发育树。[结果]供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,7株与腐皮镰刀菌为一个分支,序列相似性为98.61%~100%。菌株F94与尖孢镰刀菌为另一个分支,序列相似性为100%。菌株F83和F97与Fusarium incarnatum为另一个分支。各分枝内序列相似性均较高,为97.61%~100%,而不同分枝间菌株序列相似性较低。[结论]ITS序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供参考依据。     

16种液体处理剂对铁皮石斛组培苗促生作用研究

选用玉蜀黍赤霉、枯草芽孢杆菌、石斛小菇3种细菌和真菌菌株以及与水杨酸、硝酸镧、色氨酸、赤霉素结合配制16种液体处理剂,并以灌根方式处理,接种大棚铁皮石斛组培苗。结果表明:4g·L~(-1)石斛小菇、5mg·L~(-1)赤霉素、4g·L~(-1)石斛小菇+5mg·L~(-1)硝酸镧、4g·L~(-1)石斛小菇+5mg·L~(-1)赤霉素+1mmol·L~(-1)水杨酸处理的铁皮石斛组培苗株高显著高于对照组(无菌水处理);4g·L~(-1)石斛小菇、5mg·L~(-1)赤霉素、1mmol·L~(-1)水杨酸、4g·L~(-1)石斛小菇+5mg·L~(-1)硝酸镧、4g·L~(-1)石斛小菇+5mg·L~(-1)赤霉素+1mmol·L~(-1)水杨酸茎粗显著高于对照组。说明接种4g·L~(-1)石斛小菇、5mg·L~(-1)赤霉素、4g·L~(-1)石斛小菇+5mg·L~(-1)硝酸镧、4g·L~(-1)石斛小菇+5mg·L~(-1)赤霉素+1mmol·L~(-1)水杨酸液体处理剂处理能有效提高幼苗的株高、茎粗,液体处理剂有良好的促生效果。     

云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定及其融合群研究

2016年云南省普洱市和临沧市烟草种植区大面积发生叶部病害,经鉴定为烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn),此病为云南烟区首次发现。广泛采集2个市的烟草靶斑病病叶标本59份,采用常规组织分离法获得58个菌株,将所获菌株分别与立枯丝核菌标准融合群菌株AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9进行载玻片对峙培养,并进行菌丝融合观察,结果表明:58个菌株均属于立枯丝核菌AG-3标准融合群,且不与其他标准融合群发生融合反应。随机选取云南省6个地区各1个代表性菌株,以待测菌株的基因组DNA为模板,利用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1和ITS4对病菌rDNA ITS序列进行PCR扩增,扩增产物序列在Gen Bank中进行BLAST同源性检索比对。应用MEGA 6.06软件和NeighborJoining法,分别计算遗传距离及构建系统发育进化树分析亲缘关系。基于5.8S rDNA-ITS区序列的系统发育树进一步分析,结果表明,Rhizoctonia solani菌株的ITS序列可明显的分为2个支系,同一菌株的不同ITS序列可分别存在不同的分支中,但所有菌株的序列均隶属相同的融合群即AG-3,且隶属相同融合群的不同菌株之间其序列的一致性可高达99%~100%。     

平菇种质资源的遗传多样性分析

以43个平菇栽培菌株和11个野生菌株为材料,通过子实体颜色差异初步分类,采用拮抗法和ITS序列分析相结合的方法,对供试菌株的遗传多样性进行分析。结果表明,颜色差异较大的菌株,拮抗试验差异显著;通过拮抗法将54个菌株分为32个差异菌株;通过ITS序列分析并构建系统发育树将54个菌株聚为2个大类,2个大类遗传关系相对较远、独立进化,最终将54个菌株鉴定为36个差异菌株;拮抗试验结果与ITS序列分析结果基本一致,但第Ⅵ—Ⅸ组有较大差异。因此,拮抗试验结合ITS序列分析法可作为菌种鉴定的一个手段。     

石斛属植物rDNA ITS序列的克隆与分析

对24种石斛属植物的rDNA ITS序列进行克隆分析,以期为石斛属植物的分子鉴定和遗传多样性研究提供依据。以叶片基因组为模板,利用通用引物分别扩增24种石斛属植物的ITS序列,结果表明,ITS全长为634～646 bp,其中,58S序列的长度十分保守,均为164 bp;而ITS1和ITS2序列长度变异较大,分别为226～235 bp和241～247 bp。ITS1和ITS2序列具有丰富的变异位点,分别为176和166个;其中,信息位点分别为114和104个,发现了大量的转换、颠换和插入/缺失现象。而58S序列相对保守,有36个变异位点,其中信息位点16个。本研究表明,利用ITS序列可将本研究中的24种石斛属植物完全区分,这24种石斛属植物的遗传距离为0007～0302,其中鼓槌石斛和粟斑鼓槌石斛的遗传距离最小,亲缘关系最为接近;而金耳石斛与短棒石斛的遗传距离最大,亲缘关系最远。     

应用拮抗、ITS和RAPD技术进行香菇属菌株分类

利用拮抗、ITS和RAPD方法对14株香菇菌株进行分类鉴定和遗传多样性分析。拮抗试验表明,大多数菌株之间存在不同程度的拮抗作用,少数菌株之间没有拮抗或拮抗极不明显。ITS序列分析表明,14个菌株间的同源性均达95%以上,其中3号菌株(LC206)与5号菌株(LC2)的遗传距离非常小,表明其亲缘性很近。RAPD结果表明,相似系数在0.67以上,供试菌株分为2组,12号(L0302)菌株单独为一组,其他13个菌株为一组;相似系数在0.95以上,供试菌株分为13个组,3号与5号菌株相似系数则超过了0.95,很可能是同种异名。以上3种方法分类结果一致,说明能准确鉴定14株香菇的亲缘关系。     

内蒙古4种白粉菌的ITS序列分析

采用chelex-100法提取内蒙古地区4种白粉菌的基因组DNA,扩增其r DNA内转录间隔区序列ITS,连接载体测序,并基于ITS序列进行亲缘关系分析。结果表明,4种白粉菌形成3个进化距离较远的分支;寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列紧密聚在1支,其亲缘关系较近,同属白粉菌属;寄生在紫花苜蓿上的托罗斯内丝白粉菌和寄生在山桃上的三指单囊白粉菌各自成1支,与形态学分类结果相一致。ITS序列可用于内蒙古地区白粉菌分类鉴定研究。     

袋料香菇菌株ITS及β-tubulin序列分析

以香菇栽培袋分离菌株为研究材料,以香菇931-9为对照菌株,采用ITS及β-tubulin序列分析方法对研究材料进行鉴定。结果表明,香菇栽培袋是2种香菇菌株菌丝的混杂,与对照菌株931-9不是同一个菌株,证实青川县香菇栽培袋分离菌株与对照菌株931-9不是同一菌株。     

半夏软腐病内生拮抗真菌的筛选及鉴定

从浙江、山东、四川、江西采集的135株半夏样品中分离出76株内生拮抗菌,经过平板对峙培养法进行初筛和半夏离体块茎复筛,筛选出2株拮抗真菌SC6和SC7,这2个菌株能完全抑制软腐病的发生。通过形态学和ITS rDNA序列分析,鉴定菌株SC6和SC7均为曲霉属土曲霉（Aspergillus terreus）。     

辽宁西瓜和甜瓜细菌性果斑病的病原鉴定

辽宁省锦州市凌海市西瓜、甜瓜果实上发生疑似细菌性果斑病,从发病西瓜果实上分离获得了菌株JZ17,从发病甜瓜果实上分离纯化获得了菌株JZX2和JZT8。柯赫氏法则测定表明,接种的西瓜和甜瓜上均表现出与田间病害相同的症状,且从接种的发病植株上又重新分离到相同的菌株。采用西瓜噬酸菌检测试剂盒进行DAS-ELISA鉴定,表明3个菌株均呈阳性反应。设计特异性引物YH1/YH2,对3个菌株的16S-23S rDNA ITS序列进行扩增,3个菌株的ITS序列与西瓜噬酸菌各菌株ITS序列的同源性均高达99%以上。综上可知,菌株JZ17,JZX2和JZT8可鉴定为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)。利用特异性引物PL1/PL2对3个菌株进行亚群鉴定,结果表明菌株JZ17和对照菌株AAC00-1(亚群Ⅱ)均可扩增出大小为332 bp的片段,而菌株JZX2、JZT8和对照菌株pslbtw8(亚群Ⅰ)未扩增出此条带,因此可将菌株JZ17鉴定为西瓜噬酸菌亚群Ⅱ型菌株,菌株JZX2和JZT8鉴定为I型菌株。为比较3个菌株的亲缘关系,采用通用引物27F/1492R对3个菌株的16S rDNA序列进行扩增,获得了目的片段,在GenBank中进行同源性比对的结果表明,菌株JZ17,JZX2,JZT8与A. citrulli各菌株16S rDNA的相似性均达99%以上。利用NeighborJoining法构建的系统发育进化树结果表明,菌株JZ17与江西地区菌株JXZS6处于同一分支,菌株JZX2,JZT8与广东地区菌株XJ-6,pslb-25亲缘关系较近。首次报道辽宁省凌海市发生的西瓜和甜瓜细菌性果斑病,并鉴定其病原菌,为该病害在辽宁省的检疫和防控奠定了基础。     

产纤维素酶菌株Trametes sp.LYW-1的分离鉴定及产酶条件分析

为寻找新纤维素酶和纤维素酶基因资源,以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源,从湿润木屑中分离和筛选获得1株高产纤维素酶目的菌株LYW-1。对该菌保守序列ITS进行扩增和测序后,提交NCBI并与相近物种ITS序列进行比对和分析,基于亲缘关系构建系统发育树。将ITS rDNA保守序列比较分析结果与形态学观察结果相结合,初步鉴定该菌株属于栓菌属(Trametes)。以羧甲基纤维素钠溶液为底物,采用3’5’-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力,分析pH、温度及培养基中同碳源、氮源对该菌产纤维素酶活力的影响。结果表明,菌株LYW-1在pH 7.0、37℃、淀粉为碳源和乙酸铵为氮源时为最适培养条件,总酶活力达到最大。     

福建正红菇遗传多样性分析

以采自福建省山区的正红菇Russula griseocarnosa为研究材料,进行ITS(internal transcribed spacer)、RPB2(the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzyme II)保守区段克隆测序和序列同源性比对。将从GenBank中获得的部分红菇属物种ITS和RPB2序列与正红菇序列通过最大简约法进行系统发育分析。基于ITS序列构建的系统发育树表明,福建正红菇与云南大红菌Russula griseocarnosa X.H.Wang,Zhu L.Yang&Knudsen,sp.nov.间序列差异较小,亲缘关系较近,以99%的支持率聚为一簇。福建正红菇与欧洲红菇Russula vinosa及玫瑰红菇Russula rosea间序列差异较大,亲缘关系较远,在系统发育树上聚为不同分枝。基于RPB2序列构建的系统发育树也表明福建正红菇与云南大红菌聚为一簇(支持率94%),而与玫瑰红菇聚为不同分支。     

野生金针菇菌株的遗传学鉴定

利用拮抗反应,同工酶分析,RAPD分子标记以及ITS序列分析技术,将采自柳树的金针菇野生菌株与黄色金针菇和白色金针菇菌株进行差异性比较分析.结果表明,该野生菌株与黄色金针菇有明显的拮抗反应,S88随机引物的PCR扩增得到不同于黄色金针菇和白色金针菇的差异性条带.此外,ITS序列分析得到了九处碱基的差异.该野生菌株与两种金针菇亲缘关系较远,为进一步遗传学研究和育种工作提供一些依据.     

茶树内生球座菌的鉴定及遗传多样性分析

以分离自茶树和山茶等植物的25个内生球座菌分离物为材料,采用形态学、18S rDNA序列分析和ITS1-5.8S-ITS2序列分析相结合的方法,对这些球座菌分离物进行鉴定;并应用简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat polymorphism, ISSR)对这些菌株的遗传多样性进行分析.结果表明:所获得的25个球座菌分离物虽然在PDA培养基上的菌落形态和生长速度存在较明显的差异,但形态学特征、18S rDNA序列和ITS1-5.8S-ITS2序列分析表明这些菌株均属于芒果球座菌(Guignardia mangiferae).通过ISSR分析,从35个随机引物中筛选出10个表现多态性的引物,扩增后共获得88个ISSR标记,其中多态性标记76个,占86.3%.以相异距离0.29为标准,可以将此25个菌株划分为3个遗传聚类群,在PDA上形态相似、生长速度相近的菌株聚为一群;ISSR分析结果还显示芒果球座菌在山茶中具有更为丰富的遗传多样性.     

滇西槽舌兰内生真菌多样性及其共生真菌对叠鞘石斛种子萌发的效应

兰科植物种子萌发甚至整个生长阶段依赖于共生真菌。滇西槽舌兰（Holcoglossum rupestre）是我国特有极度濒危物种，为了更好地开展其种质资源保护，采集云南香格里拉、楚雄、昆明盘龙、昆明呈贡的滇西槽舌兰植株，基于ITS rDNA序列对其根部的内生真菌进行分离、鉴定和多样性分析，并研究这些内生真菌对叠鞘石斛（Dendrobium denneanum）种子萌发的影响。结果表明，滇西槽舌兰4个分布地植株的根内共分离、鉴定出68株内生真菌，分别属于粪壳菌纲（Sordriomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）和座囊菌纲（Dothideomycetes）3个纲18个属。其中，镰刀菌属（Fusarium）、间座壳属（Diaporthe）、胶膜菌属（Tulasnella）、角担菌属（Ceratobasidium）的相对丰度分别为27.94%、10.29%、8.82%、8.82%，为主要优势内生真菌。胶膜菌属和角担菌属为滇西槽舌兰首次分离到的兰科共生菌，且胶膜菌属的P2和P47菌株可以显著促进叠鞘石斛种子萌发进程及萌发一致性。     

利用拮抗、ITS和RAPD技术对灵芝属菌株分类的研究

为了更科学的对灵芝菌株进行分类与鉴定,利用拮抗、ITS和RAPD技术对21株灵芝菌株进行分类鉴定和遗传多样性分析。拮抗试验结果表明,大部分菌株之间存在不同程度的拮抗作用,少数菌株之间没有拮抗或拮抗极不明显;ITS序列分析结果表明,21个菌株分为3个组,菌株间遗传距离的变化范围在0.000~0.072,平均遗传距离为0.039,菌株1号(赤68)与3号(Ga15)的遗传距离为0.000,证明其亲缘性较近;RAPD结果表明,各菌株间的相似系数在0.83以上,所有菌株分为两个组,4号(867)菌株单独为1组,其它20个菌株为1组;相似系数在0.932的相似水平上,所有菌株分为14个组;1号菌株与3号菌株的相似系数则超过了0.95,有可能是同种异名。3种方法其结论一致,且能准确鉴定21株灵芝亲缘关系。     

浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

应用核糖体DNA (ribo-somal DNA,rDNA)的ITS( internal transcribed spacer,ITS)区的RFLP序列的多态性,分析32个不同寄主来源的炭疽菌株的遗传多样性.利用ITS1及ITS4通用引物对扩增各菌株的rDNA的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)获得长约600 bp片段.ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明所有来自不同寄主的炭疽菌菌株(含福建及云南菌株)都以较高的相似系数(＞0.60)聚为一类,具有较近的 亲缘关系;同时试验中所有酶切位点的综合Gst系数达到0.82,说明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性.     

基于ITS2条形码对龙虎山野生石斛资源的研究

铁皮石斛是我国名贵中草药之一,位列"中华九大仙草"之首。选取江西龙虎山铁皮石斛样品中的31株样本进行品种鉴定,采用DNA条形码对31株样本进行ITS2序列分析,利用软件MEGA6.0对筛选得到的31个ITS2序列进行遗传距离的测定和进化树的构建,确定其之间的亲缘关系,发现其中有6个品种为龙虎山特有品种,就此建立起江西龙虎山铁皮石斛资源库,为保护江西优质的石斛资源奠定理论基础。     

传统中药材麦冬的DNA条形码鉴定

该文分析了DNA条形码序列(ITS、psb A-trnH、matK、rbcL和trn L-F)对采自10个不同产区的麦冬进行PCR扩增及测序。结果表明,ITS序列变异位点为11 bp且较稳定。叶绿体序列的变异位点较低。本研究构建了ITS及联合叶绿体片段与ITS的系统发育树,4个叶绿体片段各自构建的系统发育树结果不理想,以ITS构建的系统发育树为主。广西桂林、贵州贵定与浙江余杭聚为一支;四川什都、四川珙县与广东肇庆聚为一支;云南麻栗坡与云南石林聚为一支;江西庐山与湖南桑植聚为另一分支,位于发育树基部;以上分支均得到G+C含量和遗传距离的支持,种内具有较近的亲缘关系。ITS序列具有稳定的变异位点和鉴定位点,能够准确的鉴定不同产地的麦冬,基于ITS构建的系统发育树能够较好的区分其亲缘关系。