基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括：潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。     

利用花粉管通道法将耐草甘膦基因mG2-epsps 导入玉米自交系的研究初报

构建了含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2,采用花粉管通道法将其导入优良玉米自交系X90中,对Tn代1542株植株进行草甘膦喷洒实验,共得到32株能够耐受0．25％草甘膦药液的抗性植株;对这32株抗性植株的PCR检测结果表明,其中29株为PCR阳性植株,平均转化率为1．88％;Southern杂交和Western杂交检测结果证明mG2-epspps基因已整合至玉米基因组并正确表达。     

抗虫、抗除草剂转基因玉米的获得及遗传研究

利用PIG基因枪，将cryLA(b)基因和bar基因，采用共转化法导入玉米自交系的幼胚中，经PPT筛选，获得抗性愈伤组织并再生植株。除草剂抗性检测、点杂交和Southern杂交分析表明，在多数转基因植株中cryLA(b)基因和bar基因共整合，且呈孟德尔单位点显性基因连锁遗传。Northern杂交及ELISA检测表明，cryIA(b)基因在转录和翻译水平进行也有效的表达。部分转基因植株表现出明显的抗虫活性。     

玉米转ABP9和ZmCBF3双基因植株的获得

[目的]获得转双基因的植株,研究植物逆境诱导基因ABP9和ZmCBF3的协同表达对玉米抗逆性的影响.[方法]通过农杆菌侵染的方法将ABP9和ZmCBF3基因同时转入玉米中,并对T0代植株进行分子鉴定.使用含有ABP9启动子驱动ABP9和ZmCBF3双基因载体的农杆菌侵染玉米幼穗,获得T0代种子;在田间通过对玉米苗喷洒草铵膦除草剂筛选获得具有草铵膦抗性的玉米植株.[结果]挑选10株抗性玉米苗小量提取DNA并进行PCR扩增分析,其中5个植株出现特异条带;大量提取PCR阳性玉米的DNA进行Southem杂交分析,9TQ-5号植株在与bar探针和ABP9探针杂交时均出现特异条带.[结论]9TQ-5号植株为转基因阳性植株,为后续试验提供了材料.     

鲜食玉米杂交组合抗南方锈病鉴定及其抗性遗传初析

[目的]探讨鲜食玉米杂交组合对玉米南方锈病的抗病性及抗性遗传模式,为选育抗锈病鲜食玉米新品种提供材料及理论依据.[方法]在田间自然条件下采用目测法调查鉴定244份鲜食玉米新组合对南方锈病的抗病性,并结合前期亲本材料抗性鉴定结果进行抗性遗传初步分析.[结果]在244份玉米杂交组合中,以中抗和感病品种为主,分别占总数的56.56％和33.61％,而抗病和高感的杂交组合分别占9.02％和0.82％;在甜玉米、糯玉米和甜糯玉米3种不同类型杂交组合中,甜玉米组合总体抗性最差,该类型以感病品种最多,占54.55％,抗病水平品种只占3.64％.分析鲜食玉米杂交组合及其亲本抗病性发现,当父母本抗病性均为中抗水平以上时,其杂交组合主要表现为抗或中抗水平;其他抗性水平父母本杂交,出现感病后代的比例明显升高.[结论]244份鲜食玉米新组合对玉米南方锈病的抗性主要表现为中抗,缺乏高抗或免疫类型;甜、糯玉米抗锈病能力为数量遗传性状,属主效基因加修饰基因遗传模式;鲜食玉米抗性育种应选用中抗水平以上自交系材料.     

用基因枪将P1结构蛋白基因转入玉米及其转基因植株再生研究

在构建口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)结构蛋白P1基因植物表达载体pBIl31SPl的基础上，以玉米自交系8902、340和4112的Ⅱ型胚性愈伤组织为受体，用基因枪轰击法转化玉米，获得抗性再生植株。GUS染色证明外源目的基因在玉米细胞和组织中得到了表达。PCR检测、PCR-Southern杂交、点杂交鉴定证实目的基因P1已整合到再生植株的基因组中，获得了转基因玉米再生植株。     

水稻亚种间杂交后代白叶枯病的抗性表现

研究了水稻亚种间杂交后代白叶枯病抗性的遗传行为。结果表明,亚种间杂交后代的成株期抗性呈现单个显性或隐性基因控制抗性的遗传,与亚种内杂交基本一致,但在全抗亲本的亚种间杂交后代中,部分植株苗期感病,以后转为抗病。早生爱国3号、中新120、南粳15、辛尼斯的抗病基因分别与IR_(1545-339)和IR_(28)的抗病基因呈独立遗传,IR_(28)的抗病基因与南粳15的抗病基因连锁,其重组率为20.56%。     

利用基因枪技术转化小麦、玉米的研究

采用国产JQ－700型基因枪,以含Bt基因的质粒pHB101为供体,轰击小麦、玉米愈伤组织,轰击后的愈伤组织经潮霉素抗性筛选后,获得32株小麦再生苗,14株玉米抗性植株。以a－32P－dCTP标记的PHB101质粒为探针,对小麦抗性植株进行点杂交印渍检测,发现有15株小苗显示阳性信号,且其中有一株的后代对田间蚜虫及锈病的抗性较好。玉米再生植株种植田间后在其后代中选出一抗玉米螟的稳定株系,尚需进一步的分子验证和饲虫实验。     

用基因枪转化花粉获得转基因谷子和玉米

以国产基因枪JQ-700分别将GUS（β-葡糖醛酸苷酶）基因射入谷子和玉米的花粉,经人工授粉获得种子。在加卡那霉素（Kan）的培养液中筛选获得Kan抗性植株。对抗性植株进行GUS组织化学和Southern杂交检测,结果表明有外源基因的整合与表达。转基因谷子和玉米的频率分别为0.18%和0.05%～0.21%。     

亚麻-玉米生物学性状及其亚麻酸亚油酸初步分析

将亚麻染色体及其片段作为供体,与玉米受体细胞的染色体进行染色体杂交,获得亚麻-玉米杂交植株;与对照玉米比较,其植株、叶片、果穗、营养成分等生物学性状发生明显变化。我们对亚麻-玉米杂交植株的生物学性状及其亚麻酸、亚油酸成分作一分析报道。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

Developing transgenic maize(Zea mays L.) with insect resistance and glyphosate tolerance by fusion gene transformation

Using linker peptide LP4/2A for multiple gene transformation is considered to be an effective method to stack or pyramid several traits in plants. Bacillus thuringiensis(Bt) cry gene and epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) gene are two important genes for culturing pest-resistant and glyphosate-tolerant crops. We used linker peptide LP4/2A to connect the Bt cry1 Ah gene with the 2m G2-epsps gene and combined the wide-used man A gene as a selective marker to construct one coordinated expression vector called p2 EPUHLAGN. The expression vector was transferred into maize by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and 60 plants were obtained, 40% of which were positive transformants. Molecular detection demonstrated that the two genes in the fusion vector were expressed simultaneously and spliced correctly in translation processing; meanwhile bioassay detection proved the transgenic maize had preferable pest resistance and glyphosate tolerance. Therefore, linker peptide LP4/2A provided a simple and reliable strategy for producing gene stacking in maize and the result showed that the fusion gene transformation system of LP4/2A was feasible in monocot plants.     

Field Evaluation of the Asian Corn Borer Control in Hybrid of Transgenic Maize Event MON 810

In this study,a transgenic Bt maize hybrid(event MON 810 from Monsanto Company)expressing Cry1Ab protein derived from Bacillus thuringiensis(Bt)and its negative isoline hybrid were evaluatrial. Maize plants were artificially infested with neonate larvae of Asian corn borer at the mid-whorl(firstgeneration),pre-tassel(first-and/or second-generation),and silk(second-generation)growth stages.The transgenic Bt maize hybrid sustained significantly less leaf feeding damage(rating 1.0±0.0)than its negative isoline control(rating 7.3±0.1).With the Bt maize,1.3-6.8%of plants were damaged by corn borer tunneling with＜0.5 cm tunneling per stalk under different levels of infestation,compared with 100%of plants damaged with 9.3-25.0 cm tunneling per stalk for the negative isoline control. On average,transgenic Bt maize hybrids had only 0.01-0.05 tunnels per stalk and no stems were broken.In contrast,the negative isoline control had 3.11-8.36 tunnels per stalk and 31.2-73.9% of stems broken.Yields were significantly higher in trahsgenic Bt maize than in the control. These results demonstrate that transgenic Bt maize can significantly minimize yield losses caused by the Asian corn borer through resistance to the first-and second-generation larvae.     

蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应

【目的】转基因育种是将对人类有益的外源基因通过生物技术整合进受体植物的基因组中,使其获得通过自然进化无法获得优异性状,这是转入外源基因的"预期效应"。然而,外源基因插入受体植物还可能产生无法控制和预期的细胞、代谢或表型等方面的改变,即"非预期效应"。非预期效应是转基因植物安全评价的核心内容之一,也是近年来研究的热点和难点。本研究以抗虫转基因玉米为材料,利用差异蛋白质组学技术比较研究转基因玉米与其非转基因玉米之间的非预期效应,为蛋白质组学技术解析转基因植物非预期效应提供理论参考。【方法】选取4份已经进入中国农业部安全评价阶段转苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringeinsis,Bt)内毒素基因的抗虫玉米材料,即SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd,以及它们的对照玉米材料郑单958和郑58,分别种植于可控人工温室中。待玉米幼苗生长至5叶1心期时,每份材料取长势一致的6个单株最上部完全展开叶片,混合作为一个样本进行取样,并提取叶片蛋白质。双向电泳技术分别分离4种转基因玉米和它们各自对应的非转基因材料高丰度蛋白质组,利用Image Scanner扫描仪扫描脱色后的蛋白质凝胶,PD Quest 8.0软件(Biorad,USA)分析蛋白质凝胶图谱,以蛋白点相对体积(%Vol)来表述每一个匹配蛋白质的表达丰度,将电泳凝胶上特异性蛋白质和相对体积大于2倍的差异蛋白质点取样,依据相应蛋白质数据库进行质谱鉴定,并对鉴定出的特异性和差异性蛋白质进行细胞功能富集分析(GO)和代谢途径富集分析(KEGG),以评价转基因抗虫玉米的可能非预期效应。【结果】通过比较4种不同转基因抗虫玉米及其非转基因对照的高丰度蛋白质组,除目标抗虫基因外,共鉴定出61个蛋白质,其功能主要是富集于光合作用、碳固定、能量转运等基础细胞功能相关酶类,如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等。仅有少数几个与光合作用、碳固定和ATP合成途径等基础代谢过程相关基因出现上调表达。KEGG分析表明,与对照ZD958相比,SK12-5zd的差异蛋白在光合生物碳固定途径中显著富集;Bt799zd的差异蛋白则分别在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢途径中显著富集。与对照Z58相比,IE034z和Bt799z的差异蛋白均在光合作用代谢途径中显著富集。证明4种转基因材料与对照蛋白质组相似性较高,未见基因的异常表达。【结论】测试的4种转基因材料在蛋白质水平未发生影响其安全性的非预期效应;当前结果表明蛋白质组学技术可以用来验证转基因植物的非预期效应。     

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

 用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。     

农杆菌介导法将Bt杀虫蛋白基因导入玉米自交系的研究

利用β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因的瞬时表达和稳定表达对农杆菌转化玉米愈伤组织的条件进行优化,通过用带有Bt抗虫基因和bar抗除草剂基因的根癌农杆菌LBA4404(ACT)转化玉米自交系7922、H99和P2的胚性愈伤组织,获得了抗性愈伤组织,并分化出植株,PCR检测初步证明Bt杀虫蛋白基因已整合到玉米再生植株中。     

用转基因技术进行玉米抗螟育种的研究进展

提高玉米自身的抗螟性以减轻虫害损失是一项经济、有效的方法。目前在基因水平上有两种方法可以达到快速提高玉米抗螟性的目的:一种是将外源抗性基因通过各种物理手段转入玉米植株中,形成外源转基因玉米,如转Bt基因抗虫玉米,这种方法已成功应用于现实生产中。另一种方法是利用分子标记技术定位玉米本身的抗性基因并借助与之紧密连锁的分子标记对目标性状的基因型进行选择,即分子标记辅助选择技术,这种技术已开始用于玉米抗虫育种中,而在抗玉米螟育种中还处于抗性基因的初级定位阶段。就此两种方法开展的玉米抗玉米螟育种研究的现状及其存在问题进行综述。     

葡萄糖氧化酶基因转化玉米及其后代的抗病性研究

通过花粉管通道法将葡萄糖氧化酶基因(Glucose oxidase,GO)转入玉米自交系,并对转化后代进行了大斑病抗性鉴定。结果表明,授粉后15～20h为最佳外缘基因导入时间段,最适合的转化质粒DNA浓度为100μg·mL-1。转化获得卡那霉素抗性植株244株,PCR阳性植株13株,对转化的D0代PCR阳性植株的抗病性进行了大斑病抗性鉴定,部分转化植株的抗玉米大斑病能力有所提高,其中3株表现高抗。研究为探索大众化玉米转基因和培育抗病玉米自交系提供了新方法。     

Ovipositional responses of Spodoptera frugiperda on host plants provide a basis for using Bt-transgenic maize as trap crop in China

Spodoptera frugiperda, the pest fall armyworm(FAW), is widespread in more than 100 countries. To date, planting insectresistant transgenic crops is one of the main control methods in its native countries. In this study we evaluated Bt-transgenic maize(Bt maize) and non-transgenic(conventional) maize and six other host plants in greenhouse pot experiments and field trials for oviposition preference by the Chinese populations of FAW. In laboratory trials, female moths preferred to oviposit on maize with no significant preference between conventional and Bt maize. However, after conventional and transgenic maize were exposed to FAW larvae and damaged, oviposition was significantly higher on transgenic maize than on the conventional one. Field trials showed that for plants less damaged at an early stage(seedling stage), oviposition of FAW on transgenic and conventional maize was significantly higher than that on wheat, sorghum, foxtail millet, peanut and soybean while showing no significant difference between transgenic or conventional maize. FAW adults mainly laid eggs on Bt maize, while the larval density and leaf damage rating or percentage of damaged plants were significantly lower than on conventional maize. Larval density and its damage on conventional maize were significantly higher than that on Bt maize and the other five hosts. Thus, maize is a highly preferred and suitable host for S. frugiperda feeding and ovipositing, and Bt maize can be used as trap crop to protect other crops.