以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

PEG-CaCl2�鵼ţ��֥�Ŵ�ת����ϵ�Ĺ���

为建立稳定的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)遗传转化体系,同时筛选出适宜介导牛樟芝原生质体转化的PEG-CaC12浓度.利用潮霉素抗性、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记和PCR扩增验证拟转化子.结果表明:新鲜的牛樟芝菌丝体在10 mg/mL溶壁酶溶液中,30℃条件下酶解4h,原生质体的获得率为3.55×105个/mL;菌丝体和原生质体在潮霉素B浓度分别为60 μg/mL和40μg/mL时不能生长,最终确定筛选拟转化子的潮霉素B浓度为60 μg/mL;浓度为20％～40％的PEG均可介导牛樟芝原生质体转化,且40％的PEG转化效率最高.     

PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化

为建立PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola的遗传转化体系,以果生刺盘孢SQ06-E的幼嫩菌丝为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素标记的质粒pCB1003转入果生刺盘孢菌丝的原生质体中;对获得的转化子进行遗传稳定性检测、PCR检测和Southern杂交分析。试验获得果生刺盘孢的最优转化体系为:密度为1×106 mL-1分生孢子在M3S培养基中,28℃、200r/min震荡培养8h;过滤收集菌丝,在质量浓度为0.25g/mL崩溃酶+0.05g/mL溶壁酶的10mL酶解液中加入0.5g湿菌体酶解3h;整个试验的渗透压稳定剂为0.8mol/L KCl。试验共得到76个转化子,转化率为1μg DNA获得3~4个转化子。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析都表明hph基因已整合入果生刺盘孢的基因组中。所有转化子在PDA培养基上继代5次后仍能正常生长,说明外源基因hph能在果生刺盘孢中稳定遗传。     

PEG-CaCl_2介导牛樟芝遗传转化体系的构建

为建立稳定的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)遗传转化体系,同时筛选出适宜介导牛樟芝原生质体转化的PEG-CaCl_2浓度。利用潮霉素抗性、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记和PCR扩增验证拟转化子。结果表明:新鲜的牛樟芝菌丝体在10 mg/mL溶壁酶溶液中,30℃条件下酶解4h,原生质体的获得率为3.55×105个/mL;菌丝体和原生质体在潮霉素B浓度分别为60μg/mL和40μg/mL时不能生长,最终确定筛选拟转化子的潮霉素B浓度为60μg/mL;浓度为20%~40%的PEG均可介导牛樟芝原生质体转化,且40%的PEG转化效率最高。     

以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建

使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8MNaCl(Ph5.8),28℃下,处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时,获得其原生质体。采用PEG介导的方法,将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体,并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子,获得了5-6个转化子/μgDNA的转化频率。随机挑选8个转化子,通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。     

丝状真菌转化载体的改进

为了改进农杆菌介导丝状真菌遗传转化用的Ti双元载体,将质粒pUCATPH上真菌trpC基因启动子驱动的潮霉素B抗性基因(hygB)表达盒转移到Ti质粒pPZP111上,构建成用于丝状真菌遗传转化的Ti载体pATZ。将植物表达载体pDL916上的草丁膦抗性bar基因重组到载体pKS-trpC上,构建成含真菌启动子、终止子调控的bar基因表达盒的中间载体pTrpCBar;之后将该表达盒转移到pPZP111载体上,得到以bar基因为筛选标记的真菌转化Ti质粒pTBZ。上述质粒载体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,为丝状真菌的农杆菌介导遗传转化提供了新的工具。     

高效银耳芽孢遗传转化体系的建立

【目的】建立PEG介导的高效银耳（Tremella fuciformis）芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1（含有构巢曲霉gpd-An 启动子和潮霉素抗性基因hph）和pLg-hph（含香菇gpd-Le启动子和hph基因）转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50 µg•ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100 µg•ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进银耳芽孢的基因组中,其转化率为110个/µg DNA。而pAN7-1转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明只有部分转化子基因组中整合了hph基因,其转化率只有9个/µg DNA。银耳芽孢转化子在PDSA培养基中继代5次后仍检测到hph基因的存在,表明外源基因hph能在银耳芽孢继代中稳定遗传。【结论】25%的PEG4000能高效介导银耳原生质体的转化;香菇gpd-Le启动子是银耳芽孢表达外源hph基因的强启动子;外源hph基因能够在银耳芽孢继代培养中稳定遗传。     

尖孢镰刀菌黄瓜专化型的限制酶介导整合转化

限制酶介导整合(restriction enzyme-mediated integration ,REMI)转化是在限制酶介导下用质粒DNA转化真菌原生质体,以提高大多数真菌的转化频率的一项技术.REMI的作用与原核生物的转座子技术相类似[1～3],在真菌基因标签突变、基因克隆等方面具有很大的潜力.该技术是Schiestl & Petes[1]在研究酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)时首先建立起来的.在植物病原真菌中,Lu et al.[2]首先用REMI插入突变成功标记玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus) Tox1毒素基因位点,随后,该实验室利用“质粒拯救(plasmid rescue)”的方法克隆了突变基因-PKS1[4],PKS1是T-毒素合成所必需的.在稻瘟病菌Magnaporthe grisea中利用质粒插入突变已标记了30多个与产孢、附着孢形成或致病性相关的基因[5～8] .最近,Tanaka et al.[9]利用REMI插入突变技术研究了日本梨黑斑病菌(Alternaria alternata)寄主专化性毒素(AK-毒素)生物合成所需关键基因,并成功克隆了2个与病菌产生毒素和致病相关的基因AKT1和AKT2.说明REMI插入突变技术对植物病原真菌功能基因的标记是十分有效的.     

GPAT基因表达载体的构建及对非洲菊的遗传转化

运用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶(GPAT)基因构建表达载体,将GPAT和QS115质粒中的诱导型启动子串联后,插入带有终止子PinⅡ的表达载体pCAMBIA1300质粒中。并用PCR和酶切等多种方法进行鉴定。构建后的载体经PCR和酶切鉴定表明目的基因和启动子均已按预计方式插入载体的指定位置。用农杆菌介导的方法将它们转化到非洲菊中,获得了潮霉素的抗性植株,并通过PCR扩增验证,有抗性苗含有这个抗冷基因。     

Construction and Identification of Plasmid pTA—TUB2

1　Introduction　　Benzamidazole fungicide plays an important role in plant disease control.However,as systemic fungi-cide,due to a long time application,it is facing a serious challenge from resistance problem.For instance,the resistance of Cercosporabeticola〔1〕　　　　 ,Penicillium digitatium Sacc.〔2〕Pyricularia oryzaecav〔3〕 to benzami-dazole fungicides was1 0 0 0 ︼g· m L-1.The resistance of wheat scab( Fusarium graminis)〔4〕,Botrytiscinerea〔5〕 and Sclerotinia sclerotiorum〔6…     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选

以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物.     

脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立

以中性乳糖酶生产菌脆壁克鲁维酵母为材料,构建以kan基因为筛选标记、以脆壁克鲁维酵母乳糖酶基因上游调控区为同源臂的质粒pPkan。将质粒pPkan电击转化脆壁克鲁维酵母,对受体菌生长时期、电场强度、电击后培养时间等条件进行优化。结果表明,以OD600为0.8的脆壁克鲁维酵母为受体、电压1.5 kV、电场强度为7.5 kV.cm-1、电击后培养时间为90 min,可获得较高的转化率,最高转化效率为2.37×102转化子.μgDNA。在电击转化的同时加入限制性内切酶10μL,对电击转化的转化率无显著影响。经PCR筛选证实87.5%的转化子为同源重组,从而建立一套有效的脆壁克鲁维酵母基因置换技术。     

HPLC-ELSD法测定人参茎、叶、根中7种人参皂苷含量

目的建立适合于人参茎、叶、根皂苷的高效液相色谱-蒸发光散射检测方法（HPLC-ELSD）,同时测定人参茎、叶、根中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。方法HPLC-ELSD方法,色谱柱：SHIMADZUC185μm（4.6×250mm）,流动相：乙腈-水,梯度洗脱。漂移管温度70℃,载气流速350mi/min。结果人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd分别在0.462～6.48μg、0.678～4.068μg、0.627～6.144μg、0.247～5.48μg、0.378～6.068μg、0.227～6.844μg、0.561～6.88μg呈良好的线性关系。结论该法准确、重现性好,适于人参茎、叶、根皂苷的定量分析。     

高效液相色谱法检测饼干中的三聚氰胺

建立由高效液相色谱法检测饼干中三聚氰胺的方法。样品用1%三氯乙酸和2.2%乙酸铅超声提取,色谱柱为Hypersil ODS 100 mm×4.6 mm,5μm,流动相为乙腈∶辛烷磺酸钠离子对试剂(pH 3)=15∶85(V/V),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为210 nm,柱温为40℃。三聚氰胺在0.2~10μg.mL-1范围内,有良好的线性关系。在空白样品中添加1、2和4μg.mL-1的标准工作液,平均回收率在80.5%~93.5%之间,相对标准偏差为7.7%(n=9)。     

防治柑橘黑点病室内杀菌剂筛选试验

为筛选出防治柑橘黑点病的高效、低毒、低残留杀菌剂,通过市场调研,挑选出11种防效较好的杀菌剂,采用生长速率法进行室内药效筛选试验。结果表明:11种杀菌剂中,24%腈苯唑悬浮剂抑菌作用最强,其EC50值为1.089×10-3μg/mL;25%咪鲜胺乳油、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂、75%肟菌.戊唑醇水分散粒剂和50%多菌灵可湿性粉剂5种杀菌剂EC50值范围为0.099～0.954μg/mL,具有很强的抑菌作用;78%波尔.锰锌可湿性粉剂和70%乙铝.锰锌可湿性粉剂具有较强的抑菌作用,其EC50值在1～20μg/mL之间;50%氯溴异氰尿酸可溶粉剂抑菌作用最差,EC50值达到1530.718μg/mL。     

TUB2基因鉴定及其在毛壳菌中的转化

TUB2基因为植物病原菌抗苯并咪唑类杀菌剂基因 .以pRB12 9质粒为模板对该基因进行PCR扩增 ,得到一条长约 1 4kb的DNA片段 ,经酶切鉴定证明该DNA片段是TUB2基因 .利用PEG方法 ,将含有TUB2基因的pRB12 9质粒转化于毛壳菌原生质体中 ,并在高于毛壳菌敏感的多菌灵浓度 (10 μg mL)下筛选转化子 ,此质粒转化率为 3 (2× 10 5) .使得对多菌灵非常敏感的毛壳菌能够在 30 0 μg mL多菌灵的培养基上正常生长 ,其抗药性提高了30 0倍以上 ,而且转化子稳定性试验表明 ,其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10代保持不变 .