鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上, DNA序列测定表明, 克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽. 将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG 诱导. 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白.     

山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

固始鸡白细胞介素2基因的克隆、表达及其表达蛋白活性的检测

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明,表达蛋白主要以包涵体的形式存在,表达蛋白分子质量约为18 ku;目的蛋白表达量占总量的18％。体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性。     

鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究

通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达

根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定。目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致。克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白。     

一株貉源犬瘟热病毒核衣壳蛋白的原核表达

根据GenBank中犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成1对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出约1600bp的片段,将此片段克隆于pMD18-Tsimple载体。经测序分析表明,与其它毒株N基因序列的同源性很高。再将其定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHTa中,转化感受态E.coli BL21细胞,经IPTG诱导表达分子量约63Ku的重组N蛋白。     

重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达

目的体外拼装人抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1单链抗体(LMP1 scFv)/截断的鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine,tP)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌中诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白。方法设计融合基因LMP1 scFv/tP,在LMP1 scFv/tP的5’和3’端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点;在DNAWORKS程序指导下设计成22个相互互补的寡核苷酸序列,经PCR扩增获得融合基因LMP1 scFv/tP,再将目的基因片段亚克隆至pMD 18-Tsi mple载体中,经过酶切鉴定和测序验证。进一步将目的基因片段克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并经SDS-PAGE和western blot验证。结果各寡核苷酸片段经PCR扩增后可见明确的产物带,将获得的LMP1 scFv/tP融合基因构建至原核表达载体pET32a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。结论成功获得LMP1 scFv/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白,为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗奠定基础。     

小鼠Ii基因克隆、表达及其抗体制备

为了获取小鼠Ii编码基因,利用原核表达系统进行诱导表达,提取纯化目的蛋白并制备其相应抗体,应用RT-PCR获取小鼠Ii编码基因;插入pGEX-4T-1表达载体,SDS-PAGE分析蛋白表达;纯化融合蛋白,免疫家兔,制备抗血清.结果扩增出了与预期大小相同的700 bp的特异性基因条带,其与GenBank登录的鼠Ii基因同源性高达99.2%～99.8%;SDS-PAGE检测到大小约49.5 ku的特异性蛋白条带;应用琼脂双向免疫扩散、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光法等进行抗体活性鉴定,证明获得了特异性强、具有良好生物活性的抗体.成功克隆了小鼠Ii编码基因,有效进行了诱导表达,并制备了具有良好免疫学活性的特异性抗Ii抗体.     

黑白花奶牛白细胞介素-2基因的克隆和表达

[目的]克隆牛白细胞介素-2基因(IL-2),并观察其在原核细胞中的表达。[方法]应用RT-PCR技术从黑白花奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增编码牛IL-2基因,并将其克隆到pGEX-2T原核表达质粒中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析。[结果]通过RT-PCR扩增获得500 bp的目的片段,所克隆的IL-2基因在原核细胞中成功表达,表达产物为分子量约43 kD的融合蛋白。[结论]该研究为IL-2基因的进一步研究提供了理论依据和物质基础。     

黑白花奶牛白细胞介素-2基因的克隆和表达(英文)

[Objective] The aim of this study is to clone bovine interleukin-2 gene(IL-2)and observe its expression in prokaryotic cells.[Method]Bovine IL-2 gene was amplified from total RNA of peripheral blood lymphocytes of holstein-friesian cows by RT-PCR.Subsequently,the gene was cloned into pGEX-2T prokaryotic expression plasmid to construct recombinant,which was then transformed into Escherichia Coli BL21.After IPTG induction,SDS-PAGE analysis was conducted.[Result]A 500 bp target fragment corresponding with expectation was obtained by RT-PCR.The cloned gene successfully expressed fusion protein of about 43 kD in prokaryotic cells.[Conclusion]This study provided a theoretical and material basis for further researches on IL-2 gene.     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

传染性法氏囊炎病毒部分VP2基因的克隆与原核表达

传染性法氏囊炎病毒(IBDV)是侵害雏鸡和青年鸡的重要病原,病毒VP2蛋白是主要保护性抗原。为研究不同毒株VP2基因的变异及其抗原表位特点,作者克隆、表达和鉴定了VP2基因。首先应用SPF鸡胚接种和鸡胚成纤维细胞培养法复制病毒,并以自行设计的1对引物,从中扩增出987 bp的VP2片段并进行鉴定。测序结果表明,国内不同毒株VP2高变区序列同源性达99%以上。将其部分片段插入载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转入大肠杆菌后用IPTG诱导表达。经检测,在SDS-PAGE中可见大小为44 400的融合蛋白。     

小鼠恒定链基因的克隆及鉴定

[目的]为了比较小鼠Ii链在机体免疫应答中的作用。[方法]通过自行设计的一对引物,应用RT-PCR方法,从小鼠脾脏中扩增出恒定链基因片段。[结果]经酶切和初步测序,结果表明该基因片段长度为700 bp,其DNA序列与Genbank登录的鼠Ii同源性高达99.2%。[结论]该研究为进一步研究小鼠Ii基因结构和免疫学功能提供了一定基础。     

鸡新城疫病毒F基因片段的原核表达及其抗F蛋白单克隆抗体的制备

[目的]制备鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)抗原的单克隆抗体。[方法]克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段F306,经杂交瘤技术制备了抗F蛋白的单克隆抗体。[结果]首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以保存的重组质粒为模板,通过PCR扩增获得长度为306 bp的片段,再将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F306。其次经原核表达获得大小为35.8 kD的融合蛋白,提纯后免疫Balb/c小鼠。最后,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代和分泌抗NDV-F的抗体的杂交瘤细胞株。连续传代10次后,细胞上清和腹水的抗体效价仍维持在1∶5 124和1∶64 000以上。[结论]获得了2株稳定分泌抗鸡NDV-F抗体的杂交瘤细胞。     

鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达

[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.