辣椒疫病抗病性分子鉴定技术研究

根据辣椒疫霉菌(Phytophora capsiciLeonian)核糖体(Ribosome)基因及其转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列设计两对引物,确定其中一对用于辣椒疫病抗病性的分子检测。用不同的辣椒品种进行接种,并设置不同的采样时间和部位,提取辣椒基因组和侵染到植株中疫霉菌的DNA,扩增后者的rDNA及其ITS序列。试验表明,在接种后24 h和48 h不能从辣椒叶片中检测到疫霉菌,而接种后24 h可从感病辣椒品种茎中检测到。接种后48 h均能从感病、抗病辣椒品种的茎中检测到疫霉菌,并且感病品种中疫霉菌的DNA的扩增量为100 ng,抗病品种中的为20 ng,前者是后者的5倍;辣椒品种N3中疫霉菌的DNA扩增量为77 ng,介于感病和抗病品种之间,更接近前者,因此该品种是感病的。     

贵州地方辣椒抗疫病性鉴定

以30份贵州地方辣椒为试验材料,通过苗期灌根接种法接种辣椒疫霉菌混合游动孢子囊悬浮液,鉴定材料抗病性,并对辣椒果形与其抗病性的相关性进行了初步分析。结果表明:30份材料中抗性材料1个,中抗、中感及感病材料各9个,高感材料2个。初步分析结果显示辣椒果形与其抗病性不存在明显相关性。     

辣椒不同砧木嫁接组合的疫病抗性评价及叶片防御酶活性的变化分析

为了探明嫁接对辣椒抗疫病性的影响,采用灌根法鉴定7个辣椒砧木品种对辣椒疫霉菌3号生理小种的抗性,从中筛选出TANTAN(高抗)、格拉夫特(抗)、CM334(免疫)作为砧木,以Early Calwonder(感病)为接穗进行嫁接,以接穗自根嫁接为对照,调查发病率、病情指数和嫁接苗叶片防御酶活性的变化。结果表明:嫁接辣椒的发病率和病情指数显著低于对照,且砧木抗病性越强,嫁接苗抗病性越强。在接种辣椒疫霉菌前,嫁接换根可提高接穗的PAL、PPO和β-1,3-glucanase活性,且砧木抗病性越强,这3种酶在接穗中的活性越高。在接种辣椒疫霉菌后,嫁接换根可提高接穗的PAL、PPO、β-1,3-glucanase、POD和CAT的活性,其中前3种防御酶在接种后15d,均表现为砧木抗病性越强,接穗中酶活性越高,且高酶活性持续时间越长。     

寄主诱导的基因沉默对辣椒疫霉菌的影响

由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是生产中最严重的病害之一。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术,通过瞬时表达疫霉菌基因沉默信号,在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)-疫霉菌互作系统中建立寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)体系,为防治辣椒疫病提供新思路。首先,在TRV2-GFP和对照TRV2-GUS的本氏烟叶片上接种表达GFP的致病疫霉菌菌株14-3-GFP,结果显示TRV2-GFP植株中致病疫霉菌的GFP表达显著降低,表明利用VIGS技术构建的HIGS体系在本氏烟草—疫霉菌体系中可行。此外,选取辣椒疫霉菌致病相关基因 PcAvh1、 Pchmp1和 PcGK4,构建到TRV2载体上,通过在本氏烟草中表达结合接种辣椒疫霉菌,结果显示,与对照相比植物生长表型无明显变化,表达TRV2- PcGK4的植株对辣椒疫霉菌表现抗病,表达TRV2- PcAvh1和TRV2- Pchmp1的植株对辣椒疫霉菌的抗感性没有显著影响,表明 PcGK4可能是辣椒疫霉菌致病必须的基因之一。以上结果表明,利用HIGS技术沉默辣椒疫霉菌 PcGK4基因可有效降低辣椒疫霉菌对寄主的侵染,HIGS技术可用于辣椒疫霉菌致病关键基因的筛选和鉴定。     

辣椒品种对疫病的抗性研究（I）不同互作中的水解酶活性及其与抗性的关系

研究了不同抗性的辣椒对疫霉菌侵染反应中的抗性表现及水解酶活性的变化。结果表明:辣椒对疫病的抗性表现为抗病菌扩展,β-1,3-葡聚糖酶对抗病菌在植物体内扩展起到积极作用,抗、感品种在接种疫霉菌后,β-1,3-葡聚糖酶活性均显著增加,抗、感品种增强的速度和数量差异很大。几丁质酶活性虽有所增加,抗、感品种差异不大,其在抗疫病扩展上的作用甚微。     

2个辣椒疫病抗性资源的抗性遗传分析

采用经典遗传分析方法,对来源于泰国和印度的2个辣椒疫病抗性资源Bangchang和P038的疫病抗性遗传规律进行了研究.试验将2个抗性资源分别与高感疫病自交系020和L23-9配对组合,建立各自的抗感亲本、F1(正反交)、F2及BC1(回交)4个世代群体,选用分离自广东的辣椒疫霉菌菌株ZLT0566作为侵染病原菌,用苗期灌根接种法对其各世代群体植株进行抗性鉴定,F2及BC1群体的抗感植株分离比例采用χ2测验进行适合性检测,结果表明:Bangchang对广东辣椒疫霉菌菌株ZLT0566的抗性遗传符合1对不完全显性基因控制模式,而P038的抗性遗传符合2对相互独立的不完全显性互补基因控制模式.     

辣椒疫病抗性相关的共显性RGA STS标记的开发及应用

采用辣椒抗病基因同源序列(Resistance gene ahalogues)(RGA2)设计1对特异引物,对高抗辣椒疫病品种CM334和极感疫病品种Early Calwonder(EC)进行多态性扩增,开发出共显性的RGA-STS1200标记.利用STS1200标记在具有不同疫霉菌生理小种抗性的辣椒材料CM334、PBC459、PBC137-1和对辣椒疫霉菌3个生理小种都不具抗性的辣椒材料EC、茄门和B2间进行多态性扩增.结果表明,由3个辣椒疫病抗性材料所扩增出的条带大小一致,而由3个感辣椒疫病品种所扩增出的条带大小一致.说明STS1200标记可用于鉴定辣椒疫病抗、感材料.同时,利用共显性的RGA-STS1200标记在苗期及时剔除CM334和EC正反杂交所得F1代假杂种,进一步构建用于辣椒疫病抗性研究用的F2代分离群体.这是少数报道利用RGA-STS标记对辣椒疫病抗性进行鉴定,也是第一次利用RGA-STS标记对作物种子真伪进行鉴定.     

西瓜不同品种苗期人工接种炭疽病菌后的生理生化变化

【目的】探讨西瓜苗期炭疽病抗性与叶片组织中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性及叶绿素、可溶性蛋白含量的关系。【方法】以抗性不同的西瓜品种西农八号、M08(抗病品种)和红小玉、玲珑王(感病品种)为材料,在苗期用1×106mL-1炭疽病菌孢子悬浮液接种,于接种当天(接种前)及接种后第2,4,6,8天,对西瓜叶片中与抗性有关的POD、PPO活性及叶绿素、可溶性蛋白含量进行了测定。【结果】西瓜炭疽病抗性与叶片组织中POD、PPO活性以及叶绿素、可溶性蛋白含量密切相关。接种炭疽病菌后,各品种西瓜叶片组织中POD和PPO活性都显著提高,抗病品种POD和PPO活性始终高于感病品种;叶绿素含量与品种的抗病性呈正相关;接种后各西瓜品种叶片可溶性蛋白含量均高于对照,但感病品种峰值出现时间较抗病品种早。【结论】不同抗性西瓜品种对炭疽病的抗性与POD、PPO活性及叶绿素含量存在一定的正相关,与可溶性蛋白含量存在一定的负相关。     

辣椒几丁质酶基因受疫霉菌及灰霉菌侵染时的表达变化

通过对已知全部辣椒表达序列标签(EST)数据分析发现,辣椒中至少含7个编码几丁质酶基因(分别为CaCHT-1、CaCHT-2、CaCHT-3、CaCHT-4、CaCHT-5、CaCHT-6和CaCHT-1.1)。采用半定量RT-PCR技术,分析辣椒幼苗在分别接种疫霉菌和灰霉菌后CaCHTs表达强度的变化。结果表明:在受到辣椒疫霉菌侵染时,除CaCHT-6外,CaCHT-1、CaCHT-2、CaCHT-3、CaCHT-4、CaCHT-5和CaCHT-1.1的表达水平均明显上升;而受到辣椒灰霉菌侵染时,CaCHT-1、CaCHT-4、CaCHT-5和CaCHT-1.1的表达水平均有不同程度的上升,CaCHT-3未检测到有表达,CaCHT-2和CaCHT-6的表达水平无可见的变化。结果提示,辣椒几丁质酶基因大部分成员均可受辣椒疫霉菌和灰霉菌的侵染诱导表达。     

辣椒苗期不同生长阶段对疫霉根腐病的抗性研究

准确鉴定辣椒的抗性水平对种质资源的筛选和新品种选育具有重要意义。文章采用云南的辣椒疫霉优势生理小种菌株,通过游动孢子悬浮液灌根接种法,对不同辣椒品种在苗期不同生长阶段的抗病性进行了初步研究。结果表明,在20~25℃条件下,苗龄20 d(子叶期)、40 d(3~4叶期)、60 d(5~6叶期)以及90 d(现蕾初期)的辣椒抗性、中抗以及感病品种对辣椒疫霉的抗病性表现出明显的差异,即不同苗龄生长阶段的抗病性水平由强至弱为90 d60 d40 d20 d,表明抗病、中抗及感病辣椒品种的抗性水平与苗龄呈正相关。在辣椒苗龄60 d(5~6叶)时灌根接种能够充分地反映出不同品种的抗性水平。本研究明确了进行辣椒疫霉根腐病抗性评价的适宜生长期,可为辣椒种质资源、品种抗病性筛选和鉴定提供科学依据。     

烟草品种防御酶活性对黑胫病菌响应差异

 以不同抗、感黑胫病烤烟品种云85（高抗）、K326(中抗)、净叶黄（中感）和红花大金元（高感）为供试材料,采用人工接种方法研究了黑胫病菌诱导的这些品种超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性差异及其与品种抗性的关系。结果表明,接种黑胫病后不同抗性品种SOD,POD,PPO和PAL活性与对照相比均出现明显提高,抗病品种SOD和POD活性较感病品种上升快且维持较高活性水平,且抗病品种POD酶活高峰较感病品种出现得早;抗病品种PPO和PAL较感病品种活性上升幅度更大,维持时间更长。相关性分析表明,SOD,POD,PPO和PAL活性与品种的黑胫病抗性呈正相关关系。     

苹果感染斑点落叶病菌后几种酶活性的变化

研究了苹果品种秦冠(高抗)和富士(高感)接种斑点落叶病菌(A lternaria a lternata f.sp.m a li)后叶片内5种酶活性的变化。结果表明,苹果接种斑点落叶病菌后超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)变化趋势相似,都是先升高后降低;苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)活性变化差别较大,秦冠的POD活性峰值是富士的182%,PAL活性峰值是富士的478%,均达到极显著差异。初步认为PAL和POD在抗斑点落叶病中有很大的作用。     

青枯菌侵染不同抗病烟草品种的防御性酶活性及代谢组分差异分析

【目的】为烟草抗病育种和抗性鉴定提供生化代谢指标。【方法】采用茎部注射法对抗病品种粤烟97和感病品种长脖黄接种青枯雷尔菌Ralstonia solanacearum,并采用比色法和GC-MS法分别进行相关防御性酶活性及代谢物质的测定。【结果】抗病品种粤烟97的PAL、SOD、POD、PPO活性,接菌组与对照组均分别高于感病品种长脖黄的接菌组与对照组;抗病品种粤烟97和感病品种长脖黄分别在接菌后第7天和第5天,PAL活性高于对照组,其余时间酶活性接菌组均低于对照组;抗病品种粤烟97和感病品种长脖黄在受青枯雷尔菌侵染前期,SOD、POD、PPO酶活性均提高,随着时间延长酶活性均低于对照组。POD和PPO同工酶凝胶电泳表明:抗病品种粤烟97同工酶类型多于感病品种长脖黄;接菌后第3天,粤烟97的同工酶谱带宽度与色度增强,而长脖黄无增强现象。说明抗病品种能快速应对外界刺激,加速相关抗病物质的形成。代谢物检测表明:抗病品种粤烟97接菌组中肌肉肌醇、烟碱、苹果酸、L-苏氨酸等物质的相对质量分数高于对照组,而感病品种长脖黄接菌组中这些物质均低于对照组,反映品种间抗青枯病能力的强弱可能与上述物质有关。【结论】烟草不同抗病品种叶片中PAL、SOD、POD、PPO酶活性的高低,以及上述代谢物质含量的变化,可作为反映烟草抗青枯病的生化指标。     

水杨酸对附子叶斑病的诱导抗性及作用机理研究

用5 mmol/L的水杨酸(SA)对附子抗病品种和感病品种分别进行诱导,两天后接种乌头壳针孢,研究处理后附子叶片相关酶活性的变化,结果表明,SA诱导后能明显增强附子叶片内POD、PPO、PAL的活性;诱导接种处理比对照接种处理酶活性增加更为明显,同时抗病品种比感病品种酶活性更强,增加幅度更大,高酶活持续时间更长。处理7 d后SA在抗病品种和感病品种上表现出的诱抗效果分别达30.43%和21.21%。研究表明,外施水杨酸能诱导附子抗叶斑病,在抗病品种上比感病品种上表现的更好。     

酶活性、丙二醛含量变化与豇豆抗枯萎病的关系

以豇豆抗病品种丰产二号和感病品种之豇28-2为试材,对接种枯萎病菌后2、4、6、8、10 d幼苗叶片的多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、几丁质酶(chitinase)、β-1,3-葡聚糖酶活性及丙二醛(MDA)含量的变化进行分析.结果表明:1) 未接种枯萎病菌的抗、感品种酶活性与MDA含量均无明显差异.2) 接种后,抗、感品种酶活性与MDA含量都呈升高趋势,抗病品种的酶活性升高幅度大于感病品种,抗病品种PPO、CAT活性与MDA含量始终高于感病品种.3) 接种后,抗病品种PPO、POD、CAT、几丁质酶活性升高比感病品种早,可能是它们可以较早启动抗病性反应.     

不同抗性南瓜品种感染Phytophthora capsici病菌后几种酶活性测定

采用酶活性测定法 ,对不同抗性南瓜品种感染 Phytophthora capsici病菌后几种酶活性测定。结果表明 ,过氧化物酶 (POD)、多酚氧化酶 (PPO)、苯丙氨酸解氨酶 (PAL)活性与品种抗疫病性呈正相关。抗感品种健康植株的多酚氧化酶、过氧化物酶的活性差异不显著 ,苯丙氨酸解氨酶活性差异显著。抗感品种接种后 POD的活性变化分别在 36 ,4 8,6 0 h出现 3次高峰 ,PPO的活性变化分别在 30 h,4 2 h出现 2次高峰 ,PAL 的活性变化分别在 30 ,4 8h出现 2次高峰     

大蒜抗叶枯病变异系的离体筛选及其抗性分析

【目的】利用病菌粗毒素离体筛选大蒜抗叶枯病变异系,建立抗病变异系离体筛选方法。【方法】以蒜瓣茎盘为外植体诱导愈伤组织;以大蒜叶枯病菌培养滤液制取的粗毒素为筛选剂,离体筛选大蒜抗叶枯病变异系;通过接种病菌粗毒素和病菌孢子鉴定变异株的抗病性,分析变异株的防御酶活性。【结果】大蒜叶枯病菌粗毒素对大蒜愈伤组织增殖有显著抑制作用,抑制作用随病菌粗毒素质量分数的增加而增强,不同大蒜品种愈伤组织对病菌粗毒素的抗性不同;利用不同体积分数的病菌粗毒素分步筛选分别获得大蒜品种G039变异系苗12株,G073变异系苗2株,它们对大蒜叶枯病菌粗毒素具有稳定的抗性。经病菌孢子悬浮液接种鉴定,变异系苗较其对照抗病性提高。大蒜抗叶枯病变异系苗接种病菌后叶片过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解胺酶（PAL）的活性在短时间内即达到峰值,且与抗病品种G064接近或更高,而感病品种G039的酶活性则明显低于前两者。【结论】利用不同体积分数的大蒜叶枯病菌粗毒素分步筛选可以获得大蒜抗叶枯病变异系,适宜大蒜抗叶枯病变异系分步筛选的上限粗毒素体积分数为30%;POD、PPO和PAL活性可作为大蒜抗叶枯病鉴定的生化指标。     

不同抗性南瓜品种感染Phytophthora capsici病菌后几种酶同工酶谱分析

采用电泳分离法 ,对不同抗性南瓜品种感染 Phytophthora capsici病菌后几种酶同工酶谱分析。结果表明 ,感病品种接种后与健康植株相比 ,POD、PPO酶带几乎没有增加 ,抗病品种接种后与健康植株相比 ,增加 2条 POD酶带 (Rf=0 .6 30 8,0 .70 77) ,增加 3条 PPO酶带 (Rf=0 .3,0 .6 2 86 ,0 .74 2 9)。抗感品种健康植株 POD、PPO酶带数基本相同 ,接种后抗病品种比感病品种多 3条 POD酶带 (Rf=0 .2 6 15 ,0 .6 30 8,0 .70 77)和 3条 PPO酶带 (Rf=0 .3,0 .6 2 86 ,0 .74 2 9)     

诱抗剂BTH诱导甜瓜幼苗抗白粉病相关酶活性的研究

应用植物诱抗剂苯丙噻重氮(BTH)和接种白粉菌处理抗白粉病能力不同的2个甜瓜品种,通过测定不同部位叶片过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,研究诱抗处理和病原菌侵染对甜瓜防御酶系统的影响。结果表明:BTH处理和白粉菌接种后,甜瓜叶片POD、PPO和PAL活性都显著提高;BTH对抗病品种POD、PPO活性的作用在时间和强度上都早于(大于)感病品种,BTH喷雾和白粉菌接种对不同抗性甜瓜叶片PAL活性的提高程度没有差异,但在时间上,对抗病品种的作用远早于感病品种。试验结果还表明,BTH诱导甜瓜叶片防御酶活性的效应可以通过植物的输导组织传导给其他未经处理的甜瓜组织,提高植物防御酶活性,具有系统诱导作用。     

氯化钾对玉米木质素代谢的影响及其与茎腐病抗性的关系

 【目的】阐明氯化钾（KCl）对玉米木质素代谢的影响，探讨和揭示KCl对提高玉米茎腐病抗性的机制。【方法】通过田间试验与室内分析相结合，研究了KCl对玉米不同抗性品种在接种禾谷镰刀菌（Fursarium graminearum）前后茎基部髓组织木质素含量的影响以及相关酶活性的变化。【结果】抗病品种吉单180茎基部髓组织原生木质素含量低于感病品种吉单327，但诱导木质素高于感病品种；而施用KCl则可降低原生木质素含量，增加诱导木质素含量。抗病品种茎基部髓组织苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酪氨酸解氨酶（TAL）活性高峰出现时间均早于感病品种。虽然KCl降低了接种前玉米茎基部PAL、TAL和过氧化物酶（POD）活性的本底值，却提高了接种后PAL、TAL和POD的活性，尤其是高峰值。而且在接种前后，KCl处理的玉米茎基部髓组织肉桂醇脱氢酶（CAD）活性均保持较高水平。【结论】诱导玉米在接种后PAL、TAL、POD和CAD酶系的快速反应，提高诱导木质素含量，进而增强植株对病原菌的抗性，是KCl增强玉米茎腐病抗性的机制之一。