西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较，设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物，并对所有参试菌株进行扩增。结果显示：该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带，而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用，建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术，其检测灵敏度可达到4个细菌细胞，可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。     

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan 探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高，可以快速、直接检测植物病原菌的方法，将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序，根据该细菌与其他细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测．结果表明：只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和植原体都没有荧光产生．检测的灵敏度为10^4CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高，也就是说，反应体系中只要有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到．相对灵敏度为10^7CFU／mL，而且整个检测过程只需2h，由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染．     

利用PCR技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)

根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法.     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增.结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299 bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号.与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌.     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增快速检测技术

根据香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2)的特异插入序列ISRso19设计滚环扩增的锁式探针,并对超分支滚环扩增的反应条件进行优化,建立了香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增技术。结果表明,该检测技术能够从供试的9种病原菌中特异性地检测出香蕉细菌性枯萎病菌,检测的DNA最低浓度为500 fg·μL-1,高于常规PCR的灵敏度。     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明:转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

菜豆细菌性萎蔫病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR检测

将菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)16S rDNA基因进行克隆测序,并依据此序列设计菜豆细菌性萎蔫病菌的实时荧光PCR引物和特异性探针,对所收集的样品进行了检测. 结果表明,该检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等优点,只有菜豆细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他细菌没有荧光产生. 检测的灵敏度为105 CFU/mL的细菌悬浮液,相对灵敏度为106 CFU/mL.     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

新型抑菌剂K3对青枯菌的抑制作用研究

[目的]进一步验证K3的抑菌效果。[方法]采用平板抑菌法检测了K3和农用链霉素对2011年采集的24个青枯菌样本的抑菌效果。[结果]6.0 mg/L K3对福建泰宁、三明烟草试验站、清流、尤溪、明溪、将乐、建宁,广东湖口、马市,安徽寒亭、万全、黄渡、临泉,湖南岚角、夏层,陕西乾县,江西石城,贵州余庆(1)18个县区青枯菌的抑制率为100%。8.0 mg/L农用链霉素对福建泰宁、三明烟草试验站、尤溪、明溪、将乐、建宁,广东湖口、马市,安徽寒亭、万全、黄渡、临泉,湖南岚角、夏层,陕西乾县,贵州余庆(1)16个县区青枯菌的抑制率为100%。1.0 mg/L K3对福建清流、广东马市、湖南岚角、安徽青阳、江西石城、贵州余庆(1)青枯菌的抑制率显著高于同等浓度的农用链霉素;2.0 mg/L K3对福建将乐、安徽临泉青枯菌的抑制率高于同等浓度的农用链霉素。[结论]为有效防治青枯菌提供了理论依据。     

烟草青枯病生防真菌的分离鉴定与拮抗活性的初步研究

为了获得对烟草青枯病菌(Ralstonia solancearum)具有较高拮抗活性的生防菌株,对其拮抗真菌进行了分离鉴定和活性筛选.采用系列稀释法和平板涂布法从黔江烟区土壤中分离到真菌116株.经滤纸片法测定,筛选出6株(约5.2％)对烟草青枯病菌有一定拮抗作用的菌株,并用最小抑制浓度(MIC)法测定了其中2株活性较...     

Isolation, purification and identification of three peptaibols from Trichoderma koningii with antibiotic activity against Ralstonia solancearum

The use of microorganisms for biological purposes has become an effective alternative to control plant pathogens. Trichoderma koningii Smf2 was chosen from eight Trichoderma strains for its thermostatic metabolites with antibiotic activity against Ralstonia solancearum Smith. Exclusion chromatography (LH20) was used twice to partially purify targeted metabolites combined with biological test. LC/ESI-MS, a powerful tool for rapid identification and sequence determination of peptides,…     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌hrp基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物（引物1：5‘GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3‘和引物2：5‘CGAACAGCCCACAGACAAGA-3‘）,进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验。该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组的DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌hrp基因区段1993bp的分子片段。该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术的方法。     

基于种特异性COI标记的西花蓟马温室品系和羽扇豆品系一步双重快速鉴定技术

【背景】西花蓟马（Frankliniella occidentalis）是世界性农业和园艺作物害虫,也是我国重要的对外对内检疫对象。西花蓟马具有两个品系,即温室品系（greenhouse race,GR）和羽扇豆品系（lupin race,LR）,二者在寄主范围、抗药性、生存环境等方面均具有明显差异,但外部形态相似,无法准确鉴别。【目的】以西花蓟马温室品系和羽扇豆品系为靶标,以田间常见的其他14种蓟马为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I（mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mtDNA COI）基因的种特异性（species-specific COI,SS-COI）PCR法,研究一步双重品系快速检测技术。【方法】采用mtDNA COI基因通用引物获得西花蓟马温室品系和羽扇豆品系以及其他常见蓟马的COI序列,根据测序结果以及数据库已公开数据,设计筛选获得可同时扩增两个品系的特异性组合引物（TF6/GR32/LR12）,其中TF6为品系通用上游引物,GR32为温室品系特异性下游引物,LR12为羽扇豆品系特异性下游引物,其扩增片段大小分别为温室品系362 bp、羽扇豆品系541 bp;对组合引物比例和退火温度进行优化;同时,对组合引物的种/品系特异性和灵敏性/检测阈值进行检验。【结果】当组合引物TF6/GR32/LR12比例为1.0/0.2/0.8、退火温度为44℃时,扩增效果最好。种/品系特异性检测结果证实,该检测技术仅对西花蓟马温室品系和羽扇豆品系具有扩增能力,对田间常见的其他14种蓟马包括花蓟马（Frankliniella intonsa）、禾花蓟马（Frankliniella tenuicornis）、黄胸蓟马（Thrips hawaiiensis）、大蓟马（Thrips major）、棕榈蓟马（Thrips palmi）、烟蓟马（Thrips tabaci）、普通大蓟马（Megalurothrips usitatus）、豆喙蓟马（Mycterothrips glycines）、草木樨近绢蓟马（Sussericothrips melilotus）、蔗腹齿蓟马（Fulmekiola serrata）、稻简管蓟马（Haplothrips aculeatus）、榕端宽管蓟马（Mesothrips jordani）、榕母管蓟马（Gynaikothrips ficorum）和横纹蓟马（Aeolothrips fasciatus）等不具有扩增能力。灵敏性检测结果显示,该组合引物不仅对单一品系或混合品系的成虫具有良好的扩增效果,对单粒卵、1龄和2龄幼虫以及预蛹和蛹均具有同样的扩增效能;对温室品系的最低检测阈值为35.90 pg·μL ^-1,相当于1/10 240头雌成虫,对羽扇豆品系的最低检测阈值为146.95 pg·μL ^-1,相当于1/2 560头雌成虫;同时,对来自不同地域的同一品系不同单倍型的成虫亦具有良好的扩增效能。【结论】建立的技术体系完全可以用于西花蓟马品系的快速鉴定及检疫监管,对有效阻截其进一步传播扩散及靶向防控措施制定意义重大。     

植物青枯细菌胞外蛋白在致病中作用的研究

 用含有转座子Tn5的铜绿假单胞杆菌PAO1826(pMO75::Tn5,Kmr)诱变我国马铃薯青枯菌小种3号菌株PO41,获得胞外多糖正常产生的接合子6000多个,经SDS-PAGE电泳筛选出胞外蛋白减少1～9种的菌株21株。经测试其中20株为原养型菌株,1株为营养缺陷型菌株。这21株突变株在烟草叶片上呈现典型的过敏性反应。用茎部毛细管滴注法在马铃薯植株上进行致病力测试的结果表明,胞外蛋白发生减少的21株突变株中有20株致病力均不同程度下降,通过分析突变株胞外蛋白缺失种类与致病力强弱的关系,初步确定59.5ku、55ku和47ku的胞外蛋白在青枯菌致病过程中起着十分重要的作用。     

烟草青枯菌土壤拮抗真菌的筛选及鉴定

为有效地利用生物防治技术防治烟草青枯病,提升烟草及烟草制品的产量和质量,解决使用化学防治造成的有害物质残留超标问题,通过采用平板对峙培养法、分子生物学与形态学相结合的生物防菌鉴定法等,对从健康的烟草根际土壤中分离获得的烟草青枯菌土壤拮抗真菌进行筛选和鉴定研究。结果表明:从烟草根际土壤中分离获得的56株真菌中有3株具有拮抗作用,经鉴定分别为淡色生赤壳菌(Bionec-tria ochroleuca)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)和嗜松青霉(Penicillium pinophilum),其拮抗效果从高到低依次为淡色生赤壳菌(平均抑菌圈直径达31.23mm)>棘孢木霉(11.28mm)>嗜松青(10.54mm)。     

福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

 【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析，比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布；对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析，分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成3类，即group Ⅰ、group Ⅱ和group Ⅲ；青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性：group Ⅰ为无致病性菌株，group Ⅱ为过渡性菌株，group Ⅲ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性；青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性，脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。     

根结线虫种及种群致病性的聚类分析

在相同的接种水平下,以烟草品种K326、红花大金元为供试寄主,用SAS软件,对坏死百分率、相对根结指数、相对卵块指数、株高、根长、地上部分重等6个指标进行聚类,分析不同或相似生态条件下,4种常见根结线虫中34个群体的致病性。结果表明,4种常见根结线虫的34个群体,无论对抗性寄主K326,还是感病寄主红花大金元,其致病性都能基本按种(species)划分,种间致病性存在差异;在抗性寄主上,不同来源的同种或同一小种,其致病性表现基本一致,能聚为同一相似组;在感病寄主上,除北方根结线虫外,其它3种根结线虫的致病性相近,这种归类不够明显。常见根结线虫的致病性受地理分布、生态环境、寄主类型等的影响较小。     

一株高效抑制烟草青枯病菌的烟田土壤细菌的分离与鉴定

一株筛选自重庆黔江烟区的健康土壤样品的细菌,对烟草青枯病菌有较明显的抑制作用。平板对峙试验表明:它对病原菌的抑菌圈直径达到28.9 mm。进一步对菌株的胞外产物进行粗提取和活性检测,结果表明:在粗提物浓度为250μg/片时,滤纸片法测定其抑菌圈直径为15.5 mm;MIC法测定其粗提物的IC50为342μg/mL,抑制率随着时间的延长虽稍有下降,但3 d后仍能保持在70%以上。根据该菌株的形态特征、培养性状、全细胞脂肪酸及16S rDNA序列分析结果,确定该菌株为铜绿假单胞菌属(Pseudomonas aeruginosa)。