农杆菌介导的莴笋遗传转化体系初步研究

为了研究农杆菌介导的莴笋遗传转化的影响因素,建立莴笋高效遗传转化体系,通过设置不同预培养、共培养时间,探讨其对外植体芽分化率的影响;设置不同农杆菌菌液浸染浓度及浸染时间,探讨其对外植体致死率的影响。试验结果表明,对莴笋外植体预培养2d,外植体芽分化率最高;共培养0、1、2d,外植体芽分化率差别不大;当农杆菌菌液OD600值为0.3、0.5,分别侵染1、3、5min,外植体致死率相差不大。因此,在莴笋遗传转化中,采用外植体预培养2d、共培养2d,农杆菌菌液OD600值为0.5、侵染时间5min的遗传转化体系能提高莴笋的遗传转化率。     

农标菌介导的花椰菜遗传转化体系研究

以花椰菜栽培品种“春秋”无菌苗的子叶和下胚轴为外植体 ,在携带 Ca MV Bari- 1基因 的根癌农杆菌菌种 GV310 1的介导下 ,对影响花椰菜遗传转化的诸因素进行了研究 ,建立了较为完善的转化体系 ,其转化率分别达 2 .31%和 2 .5 6 %。在这一转化体系中 ,首先将过夜培养的农杆菌用 MS无机盐液体培养基稀释 5倍或 10倍 ,感染经 2～ 3d预培养的子叶和下胚轴外植体 30 s,然后进行黑暗共培养 1d,外植体经表面灭菌后转接到含 5 0 0mg/ L 羧苄青霉素的分化培养基上。 3周后 ,将分化的不定芽切成 0 .5 cm见方的小块 ,接种在选择培养基上 ,经筛选的转化芽再诱导成苗     

影响草莓遗传转化率的因子及转CBF1基因植株的获得

以草莓试管苗的叶片为外植体,经农杆菌介导将抗逆相关转录因子CBF1基因转入草莓基因组.探讨酚类物质、农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间及选择方式等对草莓转化效率的影响,建立草莓遗传转化体系.在黑暗条件下预培养2～4 d,再用浓度OD6000.3～0.5的菌液侵染3～5 min后共培养2 d,将外植体先接到含有500 mg/L Cef的诱导培养基上进行培养,14 d后再转接到含有选择压20 mg/L Kan和500 mg/L Cef的诱导培养基上进行选择培养,得到卡那霉素抗性草莓植株.经PCR检测证实CBF1基因已整合到草莓基因组中.     

根癌农杆菌介导观赏羽衣甘蓝遗传转化体系优化

为建立稳定的羽衣甘蓝遗传转化体系,以羽衣甘蓝自交系'Mark 10','W02-7'和'Curly 6'为试材,通过单因子试验,比较羽衣甘蓝子叶、子叶柄、子叶片、下胚轴4种外植体的再生能力,筛选培养基中的适宜激素浓度,优化了羽衣甘蓝不同外植体的再生体系。将播种后6d的子叶于最适再生培养基上进行黑暗预培养,以根瘤农杆菌为介导侵染子叶后,于黑暗条件下进行农杆菌与植物材料的共培养。随后转入含有头孢霉素的抑菌培养基中进行抑菌培养,再将子叶移入含有卡那霉素浓度的筛选培养基中进行抗性芽选择,并提取植物基因组DNA进行目的基因的PCR验证,从而建立高效的羽衣甘蓝遗传转化体系。结果表明:最佳的外植体是羽衣甘蓝的子叶,在培养基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1上,不定芽分化率可达100%;子叶经2～3d预培养,将OD600值为0.3～0.5的携带DFR基因表达载体的农杆菌菌液离心,以50mL MS重悬液重悬,侵染外植体5min,共培养2d;采用头孢霉素300mg·L-1,抑菌培养3d后,采用10mg·L-1卡那霉素进行抗性芽选择。在播种后30～40d共获得了24个抗性芽,以抗性芽的基因组DNA为模板进行PCR扩增,9株呈DFR阳性,显示外源基因已经成功整合到羽衣甘蓝基因组中,平均转化率为37.5%。本研究结果可以为羽衣甘蓝重要性状基因的遗传转化提供依据。     

农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系建立

为了建立根癌农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系,以携带pBI121-gfp质粒的根癌农杆菌LBA4404菌株介导,荆芥试管苗带叶腋茎段为转化受体材料,探究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间4个因素对荆芥转化效果的影响。每个因素设置4个水平,以L16(45)正交实验进行,筛选的卡那霉素抗性芽进行GFP荧光检测和PCR检测。结果表明,gfp基因成功导入转化植株,预培养5d、菌液浓度OD600为0.7、侵染15min、共培养3d为多裂叶荆芥的最优转化条件。转化率为20%,每个外植体再生抗性不定芽数平均为5个。荆芥转化体系的建立为利用植物基因工程改良其遗传性状奠定基础。     

AP70抗病基因转化番茄的研究

[目的]通过基因工程提高番茄抗病性。[方法]通过冻融法将含萝卜抗真菌蛋白基因的质粒AP70转入农杆菌LBA4404中,再用农杆菌介导法将AP70抗病基因对番茄进行遗传转化,研究预培养、侵染时间等因素对AP70转化番茄的影响。[结果]带柄子叶诱导番茄产生不定芽的效率比子叶块效率高。农杆菌浸染番茄子叶前预培养1 d,不仅能提高子叶存活率,而且可降低共培养时外植体的污染率。农杆菌对番茄子叶的侵染时间最好不超过5 min。外植体筛选培养基中Kam的浓度不宜太高或太低,可获得少量转AP70基因的抗性芽。[结论]农杆菌对番茄子叶侵染前要进行稀释,且侵染时间不宜超过5 min,共培养1 d时转化率较高。     

保加利亚尖椒遗传转化体系的建立

以保加利亚尖椒子叶为外植体,通过农杆菌介导法将抗真菌三价载体（GCR）遗传转化至辣椒,建立了适合辣椒转化的高效再生体系,结果表明：在侵染液pH：值5．2、预培养2d、侵染时间7～8min、无AS、共培养2d的条件下,抗性不定芽的诱导分化率达到89％,转基因植株经PCR、Dot blotting检测证明外源基因已整合至辣椒基因组DNA中。     

上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究

为了得到耐贮藏的转基因柿,以上西早生柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC氧化酶的RNAi遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的壮观霉素浓度为30 mg/L,预培养时间为3 d,用OD600值为0.3的菌液侵染10 min、AS浓度100 mg/L、共培养4 d有利于提高转化频率。经PCR分子检测与GUS组织化学染色,初步确定ACC氧化酶基因已转入上西早生柿组培苗中。     

美洲商陆遗传转化体系的构建

在已构建高频再生体系的基础上,研究构建美洲商陆遗传转化体系的条件.结果表明:250 mg/L头孢霉素既能有效抑制根癌农杆菌的增殖,且对不定芽分化影响相对较小;美洲商陆对潮霉素高度敏感.美洲商陆的遗传转化过程为:无菌苗上部经增粗培养后,取茎节在不定芽分化培养基(ABDM)中预培养5d,在D600nm为0.6的菌液中侵染3 ～5 min,再转接到ABDM中黑暗、26℃共培养3d;然后外植体经冲洗后转接至含250 mg/L头孢霉素的ABDM中进行脱菌、分化以及不定芽伸长培养;待不定芽长至2 cm以上时,截取并转接到含3 mg/L潮霉素的生根培养基中进行抗性芽筛选,筛选出的抗潮霉素植株再经GFP显色、PCR、分子杂交等方法进一步阳性确认.     

地被菊雨花勋章再生和遗传转化体系的建立

以匍匐型地被菊雨花勋章叶片为外植体,建立了其高频再生体系及根癌农杆菌介导的稳定遗传转化体系.结果表明,不同激素配比对叶片离体再生影响很大,以MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA的诱导率最高,达91.1%;分化前期一定时间的暗培养可防止愈伤组织褐变,提高再生率.预培养3 d,侵染10 min,共培养3 d,延迟培养3 d为最优转化体系;乙酰丁香酮导致外植体褐化加速,不利于转化.叶片对潮霉素十分敏感,叶盘再生筛选以6～8 mg·L-1为宜,生根筛选以7 mg·L-1为宜.羧苄青霉素抑菌质量浓度以250～350 mg·L-1为宜.获得的抗性芽部分株系经PCR检测初步证实外源基因已转入植物基因组DNA中.