动物源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力与分子分型关系研究

目的调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征,探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性,为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据。方法以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象,用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力,将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定,通过金黄色葡萄球菌常见3种（spa、MLST和PFGE）分型方式进行分子分型,并分析产膜能力与分子型之间的相关性,最后通过全基因组测序技术分析生物被膜产生菌株中耐药基因和毒力基因携带状况。结果结晶紫半定量结果显示,98株金黄色葡萄球菌中能产生生物被膜的菌株共计23株,占23.47%。包括牛乳源22株（占比25.29%,22/87）,其中14株（占比60.87%,14/22）来自浙江奶牛养殖场,8株（占比39.13%,8/22）来自福建奶牛养殖场,以及猪源1株（占比9.10%,1/11）,来自广东屠宰场,说明牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力高于猪源;将产膜能力划分为强、中、弱3个等级,23株产膜菌株中,其中强产膜菌株2株（占比8.70%,2/23）,中产膜菌株9株（占比39.13%,9/23）,以及弱产膜菌株12株（占比52.17%,12/23）。药敏试验显示,牛乳源产膜菌株对所有受试抗菌药物敏感,而猪源产膜菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、头孢西丁、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、多西环素、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明、泰妙菌素、替米考星13种抗菌药均表现出耐药;spa分型结果显示,98株金黄色葡萄球菌共获得8种spa型,产膜的23株金黄色葡萄球菌占其中3种：1株t2922型来自广东猪源,14株t2119来自浙江牛乳源,8株t189来自福建牛乳源;MLST分型结果显示,98株菌共分为9种ST型,其中6种ST型不具有产生生物被膜的能力,分别为ST398、ST522、ST705、ST1651、ST479和ST151,仅3种ST型的菌株具有生物被膜产生能力,分别为ST9、ST7和ST188。结果表明,强产膜菌株分子型主要为ST7-t2119,中产膜菌株主要为ST7-t2119和ST188-t189,弱产膜菌株为ST9-t2922、ST7-t2119和ST188-t189;同时结合PCA分析不同ST型组间差异性发现,弱产膜菌株的ST型能与中强产膜菌株很好的区分开来,只有特定ST型的金黄色葡萄球菌才具有产生生物被膜的能力。23株产膜菌株PFGE分型全部成功,结果显示,广东、福建、浙江三省产膜菌株共分为3种PFGE型,且PFGE型存在地域分布特征,同一地区的分离株可能存在克隆传播,但克隆株之间生物被膜产生能力有明显差异;全基因组测序结果显示,产膜菌株中耐药基因和毒力基因根据分子型不同携带情况呈现多样性。结论不同来源的金黄色葡萄球菌有不同程度产生生物被膜的潜力,且均携带多种不同的产膜基因,牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力远远高于猪源;菌株能否产膜与ST型存在强相关性,特定的ST型如ST9、ST7和ST188更容易产生生物被膜。     

南疆巴州地区奶牛隐性乳腺炎性金黄色葡萄球菌的MLST分型及其药物敏感性分析

为了研究奶牛隐性乳腺炎性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的分子分型与药物敏感性,揭示分子分型与耐药性之间的关系,从南疆巴州地区部分奶牛场隐性乳腺炎样品中分离鉴定金黄色葡萄球菌,采用MLST分型方法进行分子分型,KB纸片法检测对五种抗菌药物的敏感性。结果表明,分离获得的25株金黄色葡萄球菌分别属于7个序列型(STs):ST22、ST398、ST5405、ST5406、ST5812、ST5819和ST5820,其中ST5812、ST5819、ST5820为新序列型。药物敏感性实验结果表明,25株金黄色葡萄球菌对诺氟沙星和克林霉素的耐药率最高,均为36%;其次为庆大霉素,耐药率为28%;对头孢西丁及头孢噻吩均敏感;属于ST398的9株菌均为多重耐药菌株。说明MLST分型与药物敏感性存在一定的相关性。     

四川鲟源海豚链球菌的毒力基因谱及分子分型

【目的】明确四川鲟源海豚链球菌Streptococcus iniae的毒力谱及分子流行病学特点,为鲟海豚链球菌病的防控提供参考。【方法】对四川地区17株鲟源海豚链球菌以及海豚链球菌ATCC29178进行毒力基因多重PCR检测,并通过随机扩增多态性DNA(RAPD)和重复序列PCR(REP-PCR)分析进行分子分型。【结果】所有菌株的7个主要毒力基因pgm、 scpI、 simA、 cpsD、 sagA、 pdi和cfi均为阳性,部分菌株的simA基因发生了变异。基于RAPD分析,18株菌分为Ⅰ、Ⅱ2个基因型;基于REP-PCR分析,18株菌分为A、B、C、D 4个基因型。【结论】四川地区17株鲟源海豚链球菌分离株均为强毒株,毒力谱为pgm/scpI/simA/cpsD/sagA/pdi/cfi,并且同时存在多种基因型的菌株,其中D型为优势流行型。     

CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”) Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计CRISPR结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带CRISPR结构(CRISPR+),513株不携带CRISPR结构(CRISP...     

中国部分地区猪源和牛源金黄色葡萄球菌耐药性及凝固酶分型研究

【目的】了解中国动物源金黄色葡萄球菌的耐药现状,以及凝固酶血清型和基因型分布情况,为控制动物源金黄色葡萄球菌的传播和流行提供理论依据。【方法】用微量肉汤稀释法测定细菌耐药性;用凝固酶分型血清确定血清型别;扩增凝固酶基因（coa）并进行序列测定,用mega软件进行序列分析。【结果】共鉴定出124株金黄色葡萄球菌。耐药性检测结果表明,在13种测试抗菌药中,金黄色葡萄球菌对氨苄西林和青霉素的耐药率最高,接近100%,其次是红霉素75%,其它10种药物的耐药率在50%以下,头孢西丁耐药率27%,未发现万古霉素耐药菌株;凝固酶血清分型率达91%,共分出6个型,VII型,VI型和复合型占优势,未分离到Ⅲ型和Ⅴ型;扩增凝固酶基因,共分为6个基因型;构建了凝固酶基因的系统进化树。【结论】中国动物源金黄色葡萄球菌的耐药状况比较严重,猪源菌株的耐药率要高于牛源菌株。凝固酶血清型别多样,分布相对较集中,具有独特的流行特征;凝固酶表型与其基因的进化特征并没有出现直接对应关系,但为进一步开展兽医临床金黄色葡萄球菌分子流行病学调查研究奠定了理论基础。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。     

奶牛源金黄色葡萄球菌新疆分离株生物被膜、肠毒素基因与毒力的检测及其相关性分析

【目的】检测奶牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)新疆分离株生物被膜、肠毒素基因分布与毒力,分析其内在联系。【方法】采用微量滴定板测定法(MPA)、PCR方法和寇氏改良法分别测定164株S.aureus新疆分离株生物被膜(BF)形成能力、肠毒素基因分布、小鼠半数致死量(LD_(50))和脏器载菌量,观察其病理组织学变化。【结果】164株S.aureus BF阳性率为83.4%,以弱BF(BF~+)菌株为主;肠毒素基因检出率为96.3%,传统肠毒素see和新型肠毒素seg检出率最高,分别为57.3%和81.1%;强BF菌株(BF~(3+))LD_(50)要高于弱BF菌株(BF~+)和阴性菌株(BF~-),但其脏器载菌量低于BF~-菌株(P0.05)。【结论】奶牛源S.aureus新疆分离株BF阳性菌株所占比例较高,其肠毒素基因携带率也较高。毒力研究表明,S.aureus分离株BF~(3+)菌株脏器载菌量低于BF~-菌株(P0.05),且随着BF形成能力的增强毒力相应减弱。     

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布与时序性表达

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用PCR技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,使用反转录荧光定量PCR研究各肠毒素基因在细菌生长周期中的表达水平变化。【结果】除see、ses和set外,其余8种肠毒素基因在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中均有检出,且sei和seg的检出率最高（27.45%）。各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致,均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达量以及不同菌株中同一肠毒素基因的相对表达量均差异较大。【结论】本文系统研究了肠毒素基因在食源性金黄色葡萄球菌中的分布,并探究了肠毒素基因的时序性表达规律,对金黄色葡萄球菌毒力机制研究与食品质量安全控制具有参考意义。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子检测与基因分型

用PCR方法对新疆乌鲁木齐周边3个奶牛场奶牛乳汁中分离到的49株金黄色葡萄球菌的entA、tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb 8种毒力基因进行分子流行病学调查,并用肠道细菌基因间重复序列-PCR(ERIC-PCR)法对这49株金黄色葡萄球菌进行基因分型.结果: tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb、entA毒力基因的检出率分别为4%、59.2%、63.3%、69.4%、22.5%、46.9%、53.1%、0,且以clfA、fnbA为主要检出毒力基因.ERIC-PCR分型结果显示:49株金黄色葡萄球菌可扩增出3～7条带,共分为4个聚类群,在同一牛场中的分离株存在不同基因型;而不同牛场中的分离株也可属于同一基因型.这种结果提示,在不同环境下同一种病原菌的基因型存在一定差异,可能存在多个金黄色葡萄球菌的流行株.     

新疆牛羊产业链中金黄色葡萄球菌的污染调查与毒力基因检测

【目的】 分析乌鲁木齐及周边地区牛羊源金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的污染状况及常见毒力基因检测。【方法】 采集乌鲁木齐及周边地区牛养殖场和牛羊屠宰场752份样品(粪样、挤奶厅工具拭子、胴体拭子、屠宰工具拭子等),采用国家标准方法进行金黄色葡萄球菌分离和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的鉴定,检测10种常见毒力基因(sea、seb、sec、fnbA、fnbB、hla、hlb、clfa、pvl、tst)的编码情况。【结果】 共分离出26株金黄色葡萄球菌,分离率为3.46%,其中奶牛养殖场、牛屠宰场和羊屠宰场的分离率分别是4.39%、1.13%、3.72%、。其中有8株是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,占检出率的30.77%。毒力基因sea、seb、sec、fnbA、fnbB、hla、hlb、clfa、pvl、tst的检测率分别是11.54%、19.23%、3.85%、3.85%、23.08%、100%、53.85%、100%、0、15.38%,其中clfa和hla的检出率最高。 【结论】 新疆奶牛养殖场和牛羊屠宰场中均存在金黄色葡萄球菌,其中奶牛养殖场中MRSA的污染较严重,金黄色葡萄球菌主要编码hla和clfa 2种毒力基因。     

肉牛呼吸道皮特不动杆菌的生物学特性分析

为探究分离自四川南充、宜宾和什邡3个地区肉牛呼吸道的皮特不动杆菌之间生物学特性的差异,本实验对5株皮特不动杆菌分别进行了细菌染色、培养特性、生化试验、16S rDNA和gyrB基因序列聚类分析以及MLST分型等研究。结果显示,5株分离自肉牛呼吸道皮特不动杆菌的菌体形态和不同培养基上的菌落形态均相似;5株菌的生化特性并非完全一致,主要表现在ZZCSF1807-9的枸橼酸盐、精氨酸双水解试验为阳性,丙二酸盐为阴性,与其余4株菌相反;16S rDNA系统进化树显示,5株菌均聚集在同一分支,而gyrB基因系统进化树显示,ZZCSF1807-9与其余4株菌未在同一分支,存在进化距离;MLST分型结果显示,ZZCSF1807-9为ST214型,而另4株菌均与ST321型最为接近。上述结果表明,来源于呼吸道疾病肉牛的5株皮特不动杆菌在生化特性表型和gyrB基因,以及MLST型上存在一定差异,发生这些差异是否与各菌株的环境适应或因毒力变化有关尚有待进一步研究。     

牛源MRSA新疆流行株的分离鉴定及spa基因多态性分型

[目的]明确新疆地区牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)流行株的流行特点,为有效防控新疆奶牛乳房炎和子宫内膜炎提供参考依据.[方法]采用分离培养、生化鉴定、药敏试验等方法对牛源MRSA进行鉴定,并以PCR扩增牛源MRSA新疆流行株spa基因的X区,测序结果列提交至spa分型数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)进行spa基因多态性分型.[结果]从221份样品中共检测出71株金黄色葡萄球菌,其中对苯唑西林抑菌直径小于10 mm的有8株;而以mecA引物进行PCR扩增,发现扩增结果呈阳性的有13株,MRSA检出率为18.3%.spa基因分型有4种,分别为t779、t2883、t13751和t1939,其中5株为t779(r08),4株为t2883(r07-r23-r21-r17-r34),2株为t13751(r07-r23-r12-r21-r17-r12),2株为t1939(r07-r23-r02-r34),即t779(r08)为MRSA新疆流行株的主要spa基因分型.[结论]MRSA在新疆不同地区均有分布,且其耐药情况不断变化,以t779(r08)为MRSA新疆流行株的主要spa基因分型.     

广东省鸭疫里默氏杆菌流行病学监测及遗传进化关系

【目的】明确广东地区鸭疫里默杆菌Riemerella anatipestifer的血清型、耐药状况及遗传进化关系。【方法】从规模化鸭场分离鉴定鸭疫里默氏杆菌,通过玻片凝集试验鉴定血清型;利用试管两倍稀释法测试抗菌药物的最低抑菌浓度,分析药物的敏感性;采用全基因组测序技术分析序列特征并构建核心基因组遗传进化树。【结果】共分离鉴定鸭疫里默氏杆菌168株,血清1、2、3、5、6、7、8、10型均有流行,血清1型的菌株高达54.17%(91/168),其次为2型,占27.97%(47/168)。48株代表性菌株对庆大霉素、卡那霉素、盐酸环丙沙星表现高度耐药,耐药率均超过80%;对土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的耐药率均在60%以上;对阿莫西林、头孢噻肟和大观霉素的耐药率低于30%。受试菌株对5～12种药物耐药,共有44种耐药谱型。成功获得46株菌株全基因组序列,共检出6种耐药基因,其中,耐药基因erm(F)和tet(X)的检出率较高,分别为73.91%(34/46)和82.60%(38/46),同时携带2种以上耐药基因的菌株占95.65%(44...     

七彩山鸡养殖场铜绿假单胞菌的耐药性、多位点序列分型及遗传进化分析

【目的】探究广东省七彩山鸡养殖场中铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的流行特点、耐药性、多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)及遗传进化背景,为临床合理用药提供参考。【方法】从广东省3个规模化七彩山鸡养殖场收集孵化死胚及周围环境样本进行铜绿假单胞菌的分离鉴定,采用K-B纸片扩散法测试其对22种抗菌药物的敏感性,利用MLST分析铜绿假单胞菌分离株的分子流行特点。将各ST型的7个管家基因序列按顺序拼接,用MEGA7软件对拼接好的序列进行遗传进化分析。【结果】在采集的514份样本(死胚样本405份、环境样本109份)中共分离到铜绿假单胞菌145株(分离率28.2%),其中,24株来源于环境样本(分离率22.0%,24/109),121株来源于死胚样本(分离率29.9%,121/405)。145株铜绿假单胞菌除对氨苄西林、卡那霉素和萘啶酸天然耐药外,对复方新诺明、氯霉素和四环素的耐药性较强,耐药率分别为100%、80.0%和77.2%,其次为头孢噻肟(耐药率23.4%)。除天然耐药外,多重耐药的铜绿假单胞菌占比达73.1%(10...     

山东省牛源金黄色葡萄球菌耐药谱分析及mecA耐药基因检测

采用纸片扩散法测定金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)对6种抗生素的敏感性。结果表明,在测定的121株金葡菌中,耐苯唑西林金葡菌(MRSA)为26株,占21.5%;对苯唑西林敏感菌(MSSA)为93株,占76.9%;中介菌株为2株,占1.6%。金葡菌对6种抗生素耐药率最低的是头孢噻肟为2株,占1.6%。mecA基因的PCR扩增结果显示:所有的MSSA mecA基因均阴性,中介株mecA基因阳性1株,而MRSA中mecA基因阳性株为9株。MSSA对大部分抗生素仍保持良好的敏感性,而MRSA表现为多重耐药性,PCR技术可以作为快速检测金葡菌耐药基因的有效方法。     

拉萨市牦牛肉源金黄色葡萄球菌的鉴定及其耐药性分析

[目的]明确西藏拉萨市牦牛肉源金黄色葡萄球菌常见肠毒素(SEs)基因分布特征及其多重耐药性,为牦牛肉源产SEs金黄色葡萄球菌的快速鉴定及其防控提供科学依据.[方法]通过Baird-Parker显色培养筛选及Nuc基因扩增鉴定从拉萨市牦牛肉样品中分离获得金黄色葡萄球菌,利用PCR鉴定分析金黄色葡萄球菌中9种常见SEs基因的分布特征,并采用K-B纸片扩散法对产SEs金黄色葡萄球菌进行多重耐药性分析.[结果]从100份牦牛肉样品中分离获得29株金黄色葡萄球菌,其SEs基因鉴定结果表明,9种SEs基因检测出6种(SEB、SEC、SEE、SEG、SHE和SEI),有3种(SEA、SED和SEJ)未检出.其中,SEG基因检出率79.31%,SEC和SEI基因检出率均为68.97%,SEB基因检出率55.17%,SHE基因检出率51.72%,SEE基因检出率3.45%.29株金黄色葡萄球菌对青霉素(P)、氨苄西林(AMP)、克拉霉素(CLR)、红霉素(E)和磺胺甲恶唑(SMZ)的耐药率较高,分别为79.31%、65.52%、58.62%、51.73%和31.04%;对阿米卡星(AK)、替卡西林(TIM)、苯唑西林(OX)、环丙沙星(CIP)和四环素(TE)的耐药率较低,分别为10.35%、6.90%、3.45%、3.45%和3.45%;对头孢西丁(FOX)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(CN)和氯霉素(C)尚未产生耐药性.29株金黄色葡萄球菌共表现出13种耐药谱,多重耐药率高达93.1%(27/29),其优势耐药谱为AMP/P、SMZ/CLR/E和AMP/P/CLR/E.[结论]西藏拉萨市牦牛肉源金黄色葡萄球菌含有SEG、SEC、SEI、SEB、SEH和SEE等多种SEs基因,且对青霉素类、大环内酯类和磺胺类等多种抗菌药物已产生较强的耐药性.     

2株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及特性研究

【目的】寻求适合制作水产类微生态制剂的益生菌。【方法】从养鱼塘底泥和健康鲫鱼Carassius auratus肠道中分离芽孢杆菌,结合细菌形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析对其进行鉴定,对菌株安全性、高温耐受性、酸性耐受性、拮抗性及产酶情况等特性进行研究。【结果】分离到2株芽孢杆菌,分别命名为B1和B2,细菌形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析的结果显示,B1和B2均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。特性研究结果证实B1、B2菌株都具有较好的安全性、高温耐受性和酸性耐受性,可对致病性大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila以及温和气单胞菌A.sobria有良好的体外抑菌能力,均具有产脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力。【结论】分离到2株性能优良的枯草芽孢杆菌,可将其作为水产微生态制剂的候选菌株。     

川西高海拔地区饲用黄芪根瘤菌的遗传多样性

为了揭示川西高海拔地区（四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州）原生野生饲用黄芪根瘤菌的遗传多样性,为筛选优良菌株提供依据,采用纯培养法从该地区部分饲用黄芪植物根瘤中分离纯化根瘤菌;通过BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA（principal component analysis）分析饲用黄芪根瘤菌的遗传多样性。结果表明,从川西高海拔地区7个县15个采样点获得10种饲用黄芪植物的根瘤,共分离纯化出36个根瘤菌菌株;在相似系数82.4%的16S rDNA PCR-RFLP分析中,所有供试菌株均与参比菌株完全分开,供试菌株聚成8个遗传群（SCAU509,SCAU553单独分开）;在相似系数83.2%的BOX-PCR分析中,饲用黄芪根瘤菌36个供试菌株和14个参比菌株聚成10个遗传群。饲用黄芪根瘤菌16S rDNA Simpson遗传多样性指数 D = 0.949。 研究显示川西高海拔地区（四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州）饲用黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性。