奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子检测与基因分型

用PCR方法对新疆乌鲁木齐周边3个奶牛场奶牛乳汁中分离到的49株金黄色葡萄球菌的entA、tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb 8种毒力基因进行分子流行病学调查,并用肠道细菌基因间重复序列-PCR(ERIC-PCR)法对这49株金黄色葡萄球菌进行基因分型.结果: tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb、entA毒力基因的检出率分别为4%、59.2%、63.3%、69.4%、22.5%、46.9%、53.1%、0,且以clfA、fnbA为主要检出毒力基因.ERIC-PCR分型结果显示:49株金黄色葡萄球菌可扩增出3～7条带,共分为4个聚类群,在同一牛场中的分离株存在不同基因型;而不同牛场中的分离株也可属于同一基因型.这种结果提示,在不同环境下同一种病原菌的基因型存在一定差异,可能存在多个金黄色葡萄球菌的流行株.     

不同动物粪源葡萄球菌耐药性调查及耐药基因检测分析

【目的】研究新疆霍城县不同动物粪源葡萄球菌对临床常用抗菌药物的耐药情况。【方法】新疆霍城县主要的规模化养殖场分别采集猪、鸡、牛及羊的粪便。采用琼脂稀释法对分离出的葡萄球菌进行最小抑菌浓度测定。通过PCR方法检测相应耐药基因。【结果】不同动物粪源葡萄球菌对被检抗菌药物耐药严重程度依次为猪粪源葡萄球菌＞鸡粪源葡萄球菌＞羊粪源葡萄球菌＞牛粪源葡萄球菌;鸡粪源葡萄球菌及猪粪源葡萄球菌对苯唑西林、四环素耐药率均超过80%。牛粪源葡萄球菌对庆大霉素和阿米卡星敏感率达100%。ermB基因是猪粪源葡萄球菌和鸡粪源葡萄球菌中检出率最高的林可胺类耐药基因,检出率分别是70.8%和93.5%;femA基因是羊粪源葡萄球菌和牛粪源葡萄球菌中检出率最高的β-内酰胺类耐药基因。【结论】新疆霍城县不同动物粪源葡萄球菌对被检抗菌药物的耐药程度不同,多药耐药情况严重,在养殖过程中应考虑耐药情况需合理使用抗菌药物。     

牛羊源沙门氏菌在某定点屠宰场和农贸市场的污染分布与耐药性调查

【目的】 研究新疆地区某定点屠宰场和农贸市场中牛羊源沙门氏菌的污染和耐药性。【方法】 在新疆乌鲁木齐市某定点屠宰场、库尔勒市某定点屠宰场和农贸市场采集的胴体拭子、肉样、加工用具拭子841份,采用国家标准方法GB 4789.4-2016进行沙门氏菌的分离鉴定,并进行17种药敏纸片的耐药性调查。【结果】 共分离出47株沙门氏菌属,分离率为5.59%。在屠宰场中沙门氏菌污染程度依次为:胴体拭子＜加工用具拭子＜肉样。而在农贸市场中沙门氏菌污染程度依次为:加工用具拭子＜肉样＜胴体拭子。对17种抗菌药物均存在不同程度的耐药,耐药率为2.13%～59.57%。多重耐药沙门氏菌数量较多,其中有1株沙门氏菌耐12种抗菌药。【结论】 市场中沙门氏菌的多重耐药比屠宰场的严重。沙门氏菌在屠宰和市场环节均存在污染,且大多数都是耐药菌株。     

乳样中金黄色葡萄球菌的靶向分离及其致临床型乳腺炎的风险分析

【目的】研究奶牛养殖场中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的分离效率,快速评估分离株致临床型乳腺炎的风险。【方法】使用葡萄球菌选择培养基结合CHROM SA显色培养基对乳样中的SA进行靶向分离,经斯皮尔曼等级相关系数分析,建立定量测定分泌性溶血素评价SA毒力的方法。【结果】对采集的64份临床型乳腺炎、157份隐性乳腺炎和213份健康乳样进行SA分离,从中分别分离出27株、21株和17株SA菌;对应样本分离株中,溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL(强毒力)的菌株分别为9株(33.3%)、1株(4.8%)和2株(11.8%)、溶血素分泌量在1 000~1 500 VH50 U/mL(中等毒力)的菌株1株(4.8%)、13株(61.9%)和4株(23.5%)、溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)的2株(11.8%)、7株(33.3%)和11株(64.7%)。临床型乳腺炎的发生与感染溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL(中、强毒力)菌株呈正相关(ρ=1,P=0.006 9),与感染溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)菌株呈负相关(ρ=-1,P=0.10)。【结论】靶向分离方法提高了SA分离效率,可真实反应奶牛养殖场中SA感染率;定量测定溶血素可用于SA毒力评价,根据中、强毒力菌株的感染情况可以初步预测临床型奶牛乳腺炎发生风险,配合临床药物敏感性试验有可能提高SA性临床型乳腺炎的治愈率,减少耐药株的扩散。     

四川兔源金黄色葡萄球菌毒力检测及分子分型

【目的】研究四川部分区域兔源金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的基因型总体结构特征、遗传变异以及毒力因子的分布情况。【方法】从四川地区分离41株兔源金黄色葡萄球菌,鉴定fem B基因特异性,进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)筛选,并通过PCR法检测13种常见的毒力基因,采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)和脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)确定基因型特征。【结果】41株金黄色葡萄球菌中共检测出MRSA 31株,检出率为75.61%;共检出9种毒力基因,其中nuc、hla、eta和clf A在所有菌株中均存在,而sea、sec、see、hlb和PVL的阳性检出率分别为9.7%、85.4%、80.5%、90.2%和7.3%。MLST分型结果显示,41株金黄色葡萄球菌只存在2种序列型(ST398、ST3320)和1个克隆群CC398,其中ST398为优势序列型,所占比例为97.6%。PFGE将41株金黄色葡萄球菌分为18个基因型,但不同区域间的基因型条带差异较小。【结论】四川调查区域兔源金黄色葡萄球菌毒力因子携带率较高,其对家兔的养殖业存在较大的安全威胁;分型分析说明四川部分区域金黄色葡萄球菌的主要流行菌株遗传变异程度小,菌株间亲缘关系较近。     

羔羊STEC的耐药性、毒力基因和血清型分析

【目的】 研究新疆羊源STEC的耐药性和毒力情况,评价羊源STEC在羊产业链饲养阶段的风险。【方法】 从某规模化羊场随机采取2月龄羊的肛拭子样本,EC肉汤增菌后用MAC平板结合双重PCR(stx1,stx2)法分离鉴定STEC,用SMAC平板结合双重PCR(rfbE和fliC)法分离鉴定E. coli O157:H7;用K-B法做9类18种药的敏感试验,并用PCR检测相应的耐药基因;用PCR检测STEC的毒力基因(eae,ehxA,hlyA,stx1a,stx1c,stx1d,stx2a等),并检测是否“Top Six”和E. coli O157:H7血清型。【结果】 被检的21只羊中,9只携带STEC(42.86%),其中1只羊还携带E. coli O157:H7;药敏试验显示仅有2株菌对头孢吡肟具有耐药性,对其他药均敏感;所有分离菌均携带stx1毒力基因,其毒力基因亚型以stx1a(60%)与stx1c(80%)为主,9株STEC不属于“Top Six”或O157血清型。【结论】 该场羊源STEC的携带率较高,主要携带致病力较弱的stx1,有E. coli O157:H7,但是没有“Top Six”血清群;该场羊源STEC对目前的抗菌素普遍敏感,反映了其良好的养殖环境和较少的抗生素使用。     

屠宰场待宰生猪及其屠宰过程中金黄色葡萄球菌的污染检测与分析

通过陕西省和河北省部分地区屠宰场的待宰生猪、屠宰环节胴体及环境采集样本,对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定与流行分析。取样地点分别在陕西咸阳某屠宰场和河北保定某屠宰场,3次共采集样品745份。分别采用国家标准GB 4789.10—2016的分离鉴定方法及显色培养基筛选、16S rRNA基因序列分析等方法进行了生猪从待宰到屠宰环节中的金黄色葡萄球菌污染检测,并进行了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)筛查。检测结果显示,从745份样品中共分离出金黄色葡萄球菌98株,总分离率为13.2%;其中,在屠宰场1a、屠宰场1b和屠宰场2样本中的检出率分别为15.6%、10.4%和13.8%,3次检测结果无明显相关性(P0.05);从采样部位看,猪鼻腔拭子样本中金葡菌阳性率最高,平均为20.5%,明显高于体表拭子样本检出率平均5.5%(P0.01),这说明待宰生猪及宰后猪鼻腔为金黄色葡萄球菌的主要污染部位;在屠宰场地面、空气及器具样本中均检出了金黄色葡萄球菌,说明屠宰场环境中存在金葡菌污染,其中以屠宰场2较为严重。进一步筛查与分析结果显示,上述98个金黄色葡萄球菌分离株中有12个为MRSA菌株(12.2%),且其中11株来自屠宰场2。对seb等10个特异性肠毒素基因的检测结果表明,携带肠毒素基因的菌株在3批(屠宰场1a、1b和2)金葡菌分离株中分别占比42.9%、29.6%和44.4%;肠毒素基因的总体检出率为10.6%,其中以sem、sei、sen、seg、sek的检出频次较高;大部分金葡菌分离株携带肠毒素基因数≤3个,但来自屠宰场2的2个MRSA菌株均携带≥5个肠毒素基因,这提示了毒力基因与MRSA菌株高致病性的关联性。研究结果表明,金黄色葡萄球菌等食源性病原菌在生猪养殖到屠宰等各个环节中都存在着不同程度的污染与传播,不同屠宰场食源性致病菌的污染传播存在一定差异。高度耐药的超级致病株MRSA在待宰生猪、屠宰环节甚至在屠宰场环境中的检出提示其对于肉食品安全的严重风险。     

渭南地区奶牛养殖场生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染状况的调查

【目的】对渭南地区奶牛养殖场生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况进行调查,为保障生鲜牛乳卫生和食用安全提供基础资料。【方法】在渭南市部分奶牛养殖场进行乳样采集,以项目团队建立的金黄色葡萄球菌的A型肠毒素(SEA)、β-内酰胺酶(BLAZ)和耐热核酸酶(NUC)基因的三重PCR方法检测样品中的金黄色葡萄球菌,对阳性样品进行细菌分离;在奶牛养殖场分别调查牛场性质、环境卫生、挤奶前的准备工作、挤奶方式与生鲜奶盛装运输等工作,结合乳样中金黄色葡萄球菌的检出情况,分析以上因素对乳中金黄色葡萄球菌污染的影响。【结果】在14个奶牛养殖场,分7次收集生鲜乳样98份,PCR检测发现金黄色葡萄球菌阳性乳样10份,阳性率10.20%(10/98),其中BLAZ基因阳性样品7份,阳性率7.14%(7/98),SEA基因阳性8份,阳性率8.16%(8/98)。在4个养殖场的乳样中检测到金黄色葡萄球菌,7次采样样品中,金黄色葡萄球菌检测1次阳性的有1个场,2次阳性的2个场,5次阳性的1个场。对这4个养殖场基本情况调查发现,均为家庭小规模养殖(奶牛头数6～9头),挤如后对鲜乳混合后进行零售;5次检测为阳性的牛场存在奶牛与其他动物混养、手工挤奶、挤乳前未对双手和牛乳房进行充分清洗和消毒。【结论】渭南地区奶牛养殖场生鲜牛乳的金黄色葡萄球菌污染率较低,造成金黄色葡萄球菌污染与奶牛养殖环境、挤乳前的消毒工作、挤乳方式密切相关,良好的养殖环境和挤乳方式将大大降低金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染。     

榅桲果实CAD基因的克隆、序列分析及表达

【目的】研究榅桲果实木质化与CAD基因的关系。【方法】基于GenBank报道的近缘物种CAD基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0 软件设计PCR 扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR 方法成功扩增出CAD 基因片段并克隆到pMD18-T 载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。通过间苯二酚染色鉴定果肉发育时期木质素的积累程度,并利用RT-qPCR对CAD基因在发育期时期的表达规律进行检测。【结果】榅桲CAD基因其开放阅读框(ORF)序列为1 071 bp,编码356个氨基酸,与其他物种序列同源性最高达96%,进化关系上与苹果较近。在果实6个发育时期,木质素积累逐渐降低,而CAD基因表达与果实木质化程度紧密相关,随着木质素合成趋缓呈现一个逐步下调的趋势。【结论】CAD基因是调控榅桲果实木质化的关键基因。     

小麦叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)基因的克隆与表达分析

【目的】研究弱光环境下叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)的表达水平变化,分析叶绿素合成途径对于弱光环境的响应。【方法】利用同源克隆,由小麦品种新冬20号克隆TaCAO并分析其序列。使用半定量PCR方法分析900、1 800、3 600和7 200 lx光照强度下TaCAO表达量。【结果】该基因ORF长度为1 653 bp,编码蛋白大小为62.12 kD,包含550个氨基酸残基,含有叶绿素转运肽和Rieske_RO_Alpha_CAO结构域,还存在一个Rieske铁硫配位中心和铁结合位点,随着光照强度的减弱,TaCAO表达量呈现上升的趋势。【结论】克隆获得的TaCAO长度为1 653 bp,具有完整的CAO活性,TaCAO的相对表达量与光照强度呈反比关系。     

甘薯茎叶多酚类物质的组分构成及抑菌活性

【目的】 研究甘薯茎叶多酚的组分构成及其抑菌活性。【方法】 采用反相高效液相色谱法,分析甘薯茎叶多酚组分构成;采用牛津杯法和最小抑菌浓度法,测定甘薯茎叶多酚及其组分对常见细菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌)及霉菌(米曲霉、米根霉)的抑菌活性。【结果】 甘薯茎叶多酚主要由7种多酚类物质组成,其中4,5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量最高(占总酚的40.18%)。甘薯茎叶多酚及其组分抑菌活性强弱顺序均为革兰氏阳性菌＞革兰氏阴性菌＞霉菌。多酚各单一组分中咖啡酸的抑菌活性最强,对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度为47 μg/mL,与阳性对照(头孢曲松钠)相同。【结论】 甘薯茎叶多酚有潜质成为一种应用于食品和医药等领域的新型天然抑菌剂。     

牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定

【目的】 诊断致犊牛腹泻冠状病毒。【方法】采集石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场141份腹泻犊牛粪样,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行冠状病毒检测,PCR方法进行核酸复检。同时根据GenBank登录的牛冠状病毒 N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到PMD 19-T载体后,将测序正确的基因片段经EcoRI和HindIII双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,进行测序,亚克隆入BL21(DE₃)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。【结果】所采集141份腹泻犊牛粪便中,用ELISA检测阳性率70.21%;再用RT-PCR检测出阳性率为61.7%同时,克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1 400 bp,双酶切鉴定目的条带正确,测序结果与标准序列的进行比对同源性达到98.22%,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE₃相对分子质量为54KD;重组蛋白BCV-32a-N-DE₃相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE₃和BCV-28a-N-DE₃和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应。【结论】犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原;ELISA方法和RT-PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义。获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好的免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础。     

饲喂荨麻干草对羊胃肠动力的影响

【目的】研究荨麻作为粗饲料对反刍动物胃肠动力的影响。【方法】以25%、50%和100%麻叶荨麻干草替代苜蓿干草饲喂新疆细毛羊,在饲喂试验的第 1 d、第 7 d、第 14 d、第 21 d和第 28 d监测其对胃肠动力的影响。【结果】第 7 d 100%荨麻组饲喂后开始反刍时间显著晚于对照组(P<0.05);第21 d 50%荨麻组和100%荨麻组羊只一个食团咀嚼次数分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)少于对照组;一个反刍过程持续时间各组之间差异不明显(P > 0.05);随着荨麻饲喂天数和添加比例的增加,在饲喂后4 h内不出现反刍羊只数量显著增加;瘤胃蠕动频率在第 28 d 100%荨麻组显著少于对照组(P<0.05);荨麻饲喂天数与饲喂后排便延迟时间在50%荨麻组(R²=0.754 6)和100%荨麻组(R²=0.753 1)具有强相关性。【结论】绵羊采食一定比例荨麻干草,具有减弱胃肠动力的作用。提示荨麻或其提取物有望用于缓解反刍动物胃肠痉挛等消化道疾病。     

9种杀虫剂对绿盲蝽的毒力效果比较

【目的】 研究不同杀虫剂对新疆阿克苏地区绿盲蝽的毒力效果,为绿盲蝽防控提供科学依据。【方法】 采用玻璃管药膜法,比较9种杀虫剂对阿克苏地区绿盲蝽成虫的毒力效果。【结果】 9种杀虫剂对绿盲蝽成虫的毒力作用均随着药剂浓度的升高而增强,其对绿盲蝽成虫的毒力效果从高到低的顺序依次为丁硫克百威>毒死蜱>呋虫胺>氟啶虫胺腈>高效氯氟氰菊酯>啶虫脒>吡虫啉>噻虫嗪>阿维菌素;阿克苏地区不同采样点绿盲蝽种群对药剂的敏感性水平不同。【结论】 在棉花花蕾期,可选用丁硫克百威、氟啶虫胺腈、呋虫胺作为目前防治该虫用的啶虫脒与高效氯氟氰菊酯等常规农药的替代药剂轮换使用,有效控制绿盲蝽发生和危害。     

石竹叶斑病病原鉴定

【目的】 研究鉴定引起新疆石河子地区石竹叶斑病的病原,为石竹叶斑病的防治提供理论基础。【方法】 采集典型石竹叶斑病发病叶片利用常规组织法分离和纯化,选取8个代表性菌株,采用菌丝块贴接法和喷雾法测定致病性;应用病菌形态学和rDNA-ITS区、组蛋白3和β-微管蛋白序列进行比对和分析,建立多基因联合系统发育树,确定病原菌的分类地位。【结果】 经形态学鉴定其分生孢子与Alternaria nobilis相似;供试菌株rDNA-ITS区和β-微管蛋白序列与已报道的石竹链格孢(A. nobilis)同源性高达99.0%以上,rDNA-ITS区和β-微管蛋白序列联合构建的系统发育树显示,8个代表菌株均与A. dianthi处于同一分支上,与其它链格孢亲缘关系较远。【结论】 引起石河子地区石竹叶斑病的病原菌为石竹链格孢Alternaria nobilis。     

哈萨克羊MSTN基因的DNA甲基化分析

【目的】研究肌肉和脂肪组织中MSTN基因(生长抑素)的DNA甲基化水平,为改良哈萨克羊品种的选育提供遗传科学依据。【方法】基于亚硫酸氢盐的方法,测序哈萨克绵羊MSTN基因在CpG二核苷酸中的DNA甲基化水平。【结论】6月龄哈萨克羊肌肉MSTN基因DNA甲基化低,脂肪组织DNA甲基化程度最高,股二头肌,股三头肌,半膜肌,半腱肌,背最长肌和脂肪组织的MSTN基因的DNA甲基化概率分别为34.7％,22.6％,23.3％,28％,42.6％和76.7％。【结论】哈萨克羊各组织MSTN基因DNA的甲基化概率没有显著差异。脂肪组织MSTN基因DNA甲基化的最高,肌肉组织MSTN基因的DNA甲基化的概率较低。脂肪的甲基化概率是背最长肌,股二头肌,股三头肌,半腱肌,半膜肌的甲基化概率分别为:1.8倍,2.2倍,3.39倍,2.74倍,3.29倍。其次甲基化从高到低的依次为:脂肪组织>背最长肌>股二头肌>半腱肌>半膜肌>股三头肌。