冷冻保存对猪精子DNA完整性及形态结构的影响

采集姜曲海猪精液,对其进行超低温冷冻保存,解冻后分别通过显微镜、扫描电镜和吖啶橙染色观察其形态、超微结构和DNA完整性,探讨冷冻保存对猪精子DNA完整性及形态结构的影响,同时探讨海藻糖和乳糖对冷冻精子的保护作用。结果表明,冷冻后精子形态正常率(海藻糖组和乳糖组分别为74.7%、67.6%)及DNA完整率(海藻糖组和乳糖组分别为66.4%和63.2%)均显著低于新鲜精子(95.5%和94.7%),且冷冻组间也存在显著差异(P0.05);冷冻造成精子结构不同程度的损伤,主要表现为精子头颈部发生部分或全部断裂,颈部肿胀,顶体结构损伤。     

猪未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的研究

研究了乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)和甘油(GLY)这4种渗透性冷冻保护剂及其两两组合对玻璃化冷冻未成熟(GV期)猪卵母细胞的影响;比较了3种不同冻前预处理方法和2种不同的解冻方法.结果表明:EG组卵母细胞所取得的成熟率为12.90%,与DMSO组(8.62%)及EG和DMSO混合组(9.61%)差异不显著(P＞0.05),但明显好于其他各组(P＜0.05);6步预处理法和3步预处理法所取得的卵母细胞存活率和成熟率显著高于1步预处理法(P＜0.05),成熟率分别为12.33%和11.11%;3步和4步解冻法取得的成熟率要显著好于1步解冻法,成熟率分别达12.70%、10.47%.     

脂质对猪未成熟卵母细胞超低温保存效果的影响

对猪卵母细胞进行直接冷冻,或冷冻前进行细胞松弛素B处理或细胞松弛素B和离心极化共处理.结果表明,各冷冻组在解冻后均获得了较高的形态正常率,但冻后FDA染色存活率均显著低于对照组,分别为56.8%、45.7%和49.0%,对照组为95.4%(P＜0.05).冻后各组体外成熟率分别为42.6%、30.4%和27.0%,均存在显著差异(P＜0.05),并显著低于对照组卵母细胞体外成熟率(73.9%,P＜0.05).仅直接冷冻后卵母细胞获得了7.8%的体外受精卵裂胚,也显著低于对照组的53.3%(P＜0.05).在此基础上,随机挑选胞质均匀、形态正常的新鲜卵母细胞和直接冷冻-解冻后卵母细胞制备透射电镜样本,观察结果表明,冷冻后卵母细胞内脂滴仅见均质状,而未见不均质脂滴.说明脂滴的变化可能是影响卵母细胞发育能力的原因之一.     

稀释液·清洁剂·冷冻程序对猪精液冷冻效果的影响

探讨了稀释液、清洁剂及冷冻程序对猪精液冷冻保存效果的影响。结果显示:①稀释液Ⅳ保存鲜精,精子活率明显低于其他组(P<0.05);但其作为冻精的解冻稀释液时,效果最佳(P<0.05),说明猪精液冷冻保存时可采用第Ⅰ～Ⅲ组稀释液,而解冻时采用第Ⅳ组较佳。②稀释液中于不同阶段添加SDS(Sodiumlaurylsulfate,十二烷基硫酸钠)或OEP(OrvusESPaste,清洁剂)均能显著提高冷冻精子活率(P<0.05),SDS与OEP对冻精活率的影响无显著差异(P>0.05)。③精液冷冻程序采用-70℃、液氮熏蒸与直接液氮熏蒸在对解冻后冻精精子活率上无显著差异(P>0.05)。添加咖啡因能有效提高冻精的解冻后活率。     

玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响

采用乙二醇(EG) 二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂处理并使用微管法冷冻保存猪卵母细胞,运用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(SCGE)方法检测玻璃化冷冻过程对细胞DNA损伤情况.结果显示:保护剂处理冷冻组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.364%、42.059%;同保护剂处理未冷冻对照组82.571%、25.758%的差异显著(P<0.05).表明冷冻保存过程对猪卵母细胞DNA有一定影响:以无冷冻保护剂处理卵母细胞为对照检测保护荆的细胞毒性,对照组形态正常率和DNA异常率分别为84.51%、12.28%,与冷冻保护剂处理组有显著差异(P,0.05).说明冷冻保护荆对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用.     

甘油浓度和平衡时间对藏獒精液冷冻效果的影响

以藏獒精液为研究对象,观察甘油浓度和平衡时间对对藏獒精液冷冻-解冻后品质的影响.试验表明,甘油浓度为2%和3%时,冷冻-解冻后精子在活力、精子畸形率和顶体完整率方面都显著优于甘油浓度1%和4%(P＜0.05),但2%和3%浓度之间无显著差异(P＞0.05);精子于甘油中经不同时间平衡后,冷冻-解冻后精子活力和顶体完整率以15 min和30 min显著优于其他平衡时间(P＜0.05),但2者之间无显著差异(P＞0.05).精液在甘油浓度为3%、甘油平衡时间为15 min时冷冻效果较好.     

奶牛体外生产胚胎玻璃化冷冻技术研究

利用乙二醇(EG)及二甲基亚砜(DMSO)作为主要冷冻保护剂,对牛体外生产囊胚进行了冷冻保存试验,探讨了不同冷冻剂组合、平衡时间、蔗糖浓度、冷冻方法对牛胚玻璃化冷冻的影响,结果显示:牛胚置于30%DMSO、15%DMSO 15%EG和30%EG等3种不同冷冻保护剂,其解冻后发育率分别为75.3%、81.8%及71.4%(P＞0.05),差异不显著;含有10%EG与10%DMSO冷冻保护剂平衡30 s、45 s及60 s,其解冻后发育率分别为54.5%、75%和44.4%,45 s显著较30 s及60 s者高(P＜0.05);以15%DMSO 15%EG冷冻保护剂中添加0.25、0.5及1.0 M的蔗糖浓度,其解冻后牛胚后续发育率分别为50%、75.0%及33.3%,蔗糖添加浓度为0.5 M者效果显著较佳(P＜0.05);利用GMP、MDS及Cryoloop3种不同冷冻方式进行冷冻,其解冻后发育率分别为66.7%、71.1%及80.0%,三者间并无显著差异(P＞0.05).     

五指山猪精液冷冻保存研究

试验利用液氮熏蒸法进行颗粒冻精,以1组冷冻保护液为对照,2组,3组冷冻保护液以氨基酸代替部分糖类物质,以解冻后的精子活力、活率和顶体完整性为判断标准,比较了4种冷冻保护液及不同冷冻-解冻程序对五指山猪精液冷冻的影响。结果表明:解冻后精子2组,3组的3个判断标准均显著高于1组(P<0.05);4组(2.5 mL DMSO)冷冻保护液解冻精子的活力和活率显著低于2组(2 mL甘油)和3组(1.25 mL DMSO 1 mL甘油)(P<0.05)。精清保留量为0 mL/10 mL时解冻精子的活率和活力显著低于0.5 mL/10 mL和1 mL/10 mL(P<0.05)。干解法解冻后精子活率显著高于湿解法(P<0.05)。     

除去精浆、添加维生素E及水浴平衡对莎能奶山羊精液冷冻效果的影响

主要探讨精液离心、添加VE及平衡方法对山羊细管冻精冷冻-解冻后活力、顶体完整率等的影响,为提高山羊精液冷冻保存效果提供依据.试验1:将鲜精稀释后分为3组,第1组为稀释精液1 000 r/min离心6 min,去掉一半的上清液;第2组用相同的方法反复离心3次,完全去掉精浆;第3组不离心,做为对照.试验2:在稀释液中添加15 g/L VE,以不添加组作为对照.试验3:采用纱布包裹和水浴平衡两种方法.试验结果表明,离心去掉部分精浆组和离心去精浆组精子冷冻-解冻后的活力比不离心组高,差异显著(P＜0.05).精子顶体完整率和畸形率有所下降,但与对照组相比较差异不显著(P＞0.05).离心去掉部分精浆组和离心完全去精浆组相比,精子冷冻一解冻后的活力、顶体完整率和畸形率差异不显著(P＞0.05).冷冻稀释液中添加VE组的顶体完整率显著提高(P＜0.05),畸形率变化与对照组无差异(P＞0.05),精子活力提高效果也不明显(P＞0.05).精液冷冻前平衡方法以水浴法为好,与纱布包裹平衡组相比,水浴平衡组的活力和顶体完整率高(P＜0.05),精子畸形率较低(P＜0.05).可见,精液离心后去掉适量精浆可显著提高冷冻后精子的活力;添加VE可显著提高精液冷冻后精子的顶体完整率;与纱布包裹平衡法相比,水浴平衡法可显著提高精液冷冻后精子的品质.     

稀释液中卵黄浓度对猪精液冷冻保存效果的影响

为探索卵黄在猪精液冷冻中的应用效果,筛选出猪精液冷冻稀释液中卵黄的最佳浓度,分别在猪精液冷冻稀释液中添加不同比例（20%、25%、30%）的卵黄,并以精子活率、活力、路径速率（VAP）、轨迹速率（VCL）、直线运动速率（VSL）等为指标,对猪精液稀释后、平衡后和冷冻后3个阶段的精液质量进行比较分析。结果表明,将猪精液冷冻稀释液中卵黄的添加量提高5～10个百分点,其稀释后、平衡后及解冻后3个阶段精子的5个运动参数与常规添加量相比均无显著差异（P〉0.05）。可见,提高猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度未能显著改善猪精液冷冻后的质量,综合考虑,猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度仍以20%（v/v）为宜。     

中间球海胆精子超低温冷冻损伤的研究

应用透射电镜技术研究了超低温冷冻保存对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子超微结构的影响。结果表明：不加抗冻剂的情况下,精子线粒体和顶体结构不完整,质膜、鞭毛破损。加入保护剂后,多数精子结构完好,部分精子细胞器受损,表现为质膜褶皱或膨胀举起,与核膜的间隙明显增大;顶体肿胀、破裂或脱落;线粒体嵴间隙增大,内部出现空泡,甚至线粒体内膜破损,内嵴减少,呈弥散状;鞭毛被膜肿胀,呈波浪状,＂9＋2＂型结构模糊;细胞核结构没有明显变化。应用单细胞凝胶电泳技术研究了精子冷冻保存前后DNA的损伤。结果表明,不加抗冻剂的冷冻组及添加抗冻剂的试验组精子DNA损伤情况与鲜精相比均无显著差异（P〉0.05）,冷冻对精子结构的损伤是造成精子活力及受精率下降的主要原因。     

性控冻精的DNA损伤及其检测方法

性控冻精的广泛应用给现代畜牧业带来了巨大的利益。性控冻精在制作生产过程会受到高倍稀释、离心、激光照射、染色及冷冻等诸多因素的影响,而使精子DNA的完整性发生变化,结果降低受胎率,同时会对性控后代的遗传稳定性产生影响。精子DNA损伤检测方法有彗星实验（COMET assay,single cell gel electrophoresis SCGE）,末端转移酶介导的d UTP末端标记法（Terminal tranferase d UTP Nick End Labelling TUNEL）,精子染色质结构分析（sperm chromatin structure assay SCSA）和精子染色体扩散实验（Sperm chromatin dispersion SCD）等。本文综述了近年来精子DNA损伤检测方法的使用概况,对比了不同方法对检测结果的优势,为更好的评价性控冻精的质量,确定分离参数,及为生产受精率高、安全性高的性控冻精提供依据。     

5种禽类卵黄低密度脂蛋白对猪精子冷冻效果的影响

为了确定具有最佳抗冷冻效果的禽类卵黄低密度脂蛋白(LDL)及其添加质量分数,在猪精液冷冻稀释液中分别添加质量分数为6%、7%、8%、9%和10%的鸡、鸭、鹌鹑、鸽子和鸵鸟的卵黄LDL,分析不同禽类的LDL对猪精子的冷冻保存效果。结果表明,稀释液中添加质量分数为9%的鸡、鸭、鹌鹑、鸽子卵黄LDL以及质量分数8%的鸵鸟卵黄LDL时,冷冻-解冻后精子活率最高,分别达到42.33%、35.63%、31.47%、47.33%和36.40%。以5种禽类LDL最佳质量分数配制冷冻稀释液冷冻精子,发现质量分数为9%的鸽蛋LDL冻存猪精子时解冻后精子活率达到47.33%,顶体完整性达到62.57%,质膜完整性达到48.13%,均显著优于其他处理组(P<0.05)。说明鸽子卵黄LDL对猪精子具有良好的冷冻保护性能,可提高猪精子抵抗低温打击的能力。     

双糖对冻融后猪精子质量的影响

在传统的Tris—柠檬酸—葡萄糖(TCG)稀释液基础上,分别添加0.1 mol/L乳糖、蔗糖、海藻糖,并采用细管法对精液进行冷冻,研究不同双糖对冻融后猪精液质量的影响。结果表明:0.1 mol/L的海藻糖和蔗糖相对于对照组和0.1 mol/L的乳糖TCG稀释液能够显著改善冻融后猪精子质量,其冻融后精子的活率、顶体完整率、低渗膨胀率、平均路径速度、运动线速度、平均侧摆幅度和平均鞭打频率均明显提高(P0.05),分别达到42.14%和40.56%,51.48%和49.84%,46.20%和43.01%,32.8μm/s和33.2μm/s,60.80%和59.00%,1.70μm和1.62μm,7.68 Hz和7.62 Hz。TCG稀释液中添加0.1 mol/L海藻糖和蔗糖的猪冷冻精液体外受精的受精能力明显高于0.1 mol/L乳糖组和对照组,其卵裂率分别为41%和38%。     

陆川猪与外来猪精液质量及精子黏附蛋白基因家族 mRNA表达的比较

精子黏附蛋白基因家族是公猪精液中精浆蛋白的最主要成分,对精子的活力、获能和与卵子的结合都会起到调控作用。为了研究不同猪种之间繁殖力的差异,试验以陆川猪、长白猪和杜洛克猪为研究对象,以常规方法检测新鲜精液的精子活力、活率及畸形率,并应用半定量RT-PCR技术检测精子黏附蛋白基因家族mRNA的表达,最后采用单因素方差分析法分析数据之间差异的显著性。结果表明,陆川猪的精子活力及活率与长白猪、杜洛克猪差异不显著（P>0.05）,但是精子畸形率极显著低于2种外来猪种（P<0.01）;陆川猪精子黏附蛋白基因家族中仅 AQN1基因 mRNA表达水平显著低于杜洛克猪（P<0.05）,其余与长白猪、杜洛克猪之间无显著差异（P>0.05）;长白猪精液中精子黏附蛋白基因家族的 AQN3、AWN和PSP-II基因 mRNA表达水平显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于杜洛克猪。总之,不同猪种精子黏附蛋白基因家族 mRNA表达水平存在明显差异,但与精子活力、活率及畸形率等精液质量指标的高低没有规律性的关联。     

高繁殖力和低繁殖力长白公猪的精子DFI差异分析

【目的】探究高繁殖力和低繁殖力长白公猪的精液品质及精子DNA损伤差异,为筛选出高繁殖力种公猪提供参考依据,进而优化猪场人工授精工作及提高种猪场的经济效益。【方法】选取12头法系长白公猪,通过分析繁育数据将其分组为高繁殖力和低繁殖力公猪,各6头;利用计算机辅助精子分析系统(CASA)对公猪精液品质参数进行检测分析,然后通过流式细胞仪检测精子DNA碎片指数(DFI)和活性氧(ROS)水平。【结果】高繁殖力公猪的平均窝产仔数和活产仔数均极显著高于低繁殖力公猪(P<0.01,下同),但二者的畸胎数和死胎数差异不显著(P>0.05,下同)。高繁殖力公猪精子的前进运动率显著高于低繁殖力公猪精子(P<0.05,下同),而精子畸形率极显著低于低繁殖力公猪,但二者在近端原生质滴率、远端原生质滴率及折尾率等方面的差异均不显著;除了高繁殖力公猪精子的曲线速率(VCL)显著高于低繁殖力公猪外,其他的运动参数均无显著差异;高繁殖力公猪的精子DFI和ROS水平均极显著低于低繁殖力公猪。长白公猪产仔数与各项精液质量参数的相关分析发现,公猪产仔数与精子DFI呈高度负相关(r=-0.85)、与精子畸形率(r=-0.70)和精子ROS水平(r=-0.78)呈中度负相关;公猪精子畸形率与精子DFI(r=0.63)和ROS水平(r=0.62)呈中度正相关;精子DFI和ROS水平呈高度正相关(r=0.93)。【结论】精子DNA碎片化与公猪繁殖力密切相关,即精子DFI可为评估公猪精液品质及繁殖力提供重要参考依据。因此,在筛选种公猪时精子DFI检测可作为公猪精子质量评估的补充手段,以协同人工授精技术提高受精率及猪场经济效益,进而推动养猪业的高质量发展。     

应用单细胞凝胶电泳技术评价复合微生态制剂的遗传毒性

采用DNA损伤检测技术———单细胞凝胶电泳技术(SCGE,又名彗星试验)来检测复合微生态制剂对鱼类DNA的损伤,尝试利用鱼类的单细胞凝胶电泳技术来评价外来化学物质对水生生态环境的影响。试验结果表明,复合微生态制剂对鱼类的DNA没有明显的损伤作用,各试验浓度组与对照组相比没有显著性差异(P>0.05),复合微生态制剂对水体生态环境具有安全性。试验同时表明,鱼类肾细胞的DNA损伤可作为评价外来化学物质遗传毒性的生物标志物。     

不同抗氧化剂对金华猪精液冷冻保存效果的影响

为了观察冷冻稀释液中添加不同浓度的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、绿茶多酚(GTPs)、维生素E(VE)和超氧化物歧化酶(SOD)对金华猪精液冷冻保存效果的影响,分别在冷冻稀释液中添加0.125、0.25、0.5 mmol.L-1的GSH,10、15、20 mmol.L-1的GTPs,1、2、4 mg.mL-1的VE和1 000、2 000、4 000 I U的SOD,采集活率较高的金华猪精液,用上述含抗氧化剂的冷冻稀释液稀释后进行冷冻保存,分别检测4个处理组精子4℃平衡后的活率和解冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整率。结果表明,在金华猪精液的冷冻稀释液中分别添加15 mmol.L-1GTPs、2 mg.mL-1VE、4 000 I U SOD可显著提高猪精子4℃平衡后的活率、解冻后精子活率和质膜完整率(P0.05)。     

超低温冷冻对俄罗斯鲟精子抗氧化酶活性的影响

为了探讨超低温（-196℃）对精子的损伤机理,采用试剂盒测定了冷冻前后俄罗斯鲟精浆和精子中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）和谷胱甘肽还原酶（GR）等酶活性。结果表明,经过超低温冷冻保存后,俄罗斯鲟精子活力下降,添加抗冻保护液冷冻后的精浆中SOD、CAT、GSH—PX活性较鲜精组显著升高（P〈0．05）,较未添加保护液组显著降低（P〈0．05）,GR的活性则显著低于鲜精组（P〈0．05）,但显著高于未添加保护液组（P〈0．05）;添加抗冻保护液冷冻后的精子中SOD、CAT、GSH—PX活性较鲜精组显著降低（P〈0．05）,较未添加保护液组显著升高（P〈0．05）,GR活性则显著高于鲜精组（P〈0．05）,但显著低于未添加保护液组（P〈0．05）。这说明超低温冷冻对俄罗斯鲟精子的抗氧化系统产生了较大影响,成为影响精子活力的一个重要原因。     

他克林对猪精子冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响

旨在研究他克林对猪精液冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响机制。手握法采集12头18～24月龄健康杜洛克种公猪精液,在其冷冻保存稀释液中加0.10mmol/L他克林并冷冻保存,检测冻后精子活率、质膜完整率、顶体完整率和畸形率、线粒体膜电位、DNA完整性,同时利用试剂盒检测总抗氧能力、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、总胆固醇含量、丙酮酸含量及己糖激酶活性。结果表明,与鲜精相比,冻融后精子活率和质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、DNA完整性、抗氧化能力及糖代谢指标均极显著下降,畸形率极显著升高。与空白组相比,他克林显著提高冻后精子顶体完整率、DNA完整率、超氧化物歧化酶、丙酮酸含量;极显著提高精子活率、质膜完整率、线粒体膜电位、总抗氧能力、丙二醛含量、总胆固醇含量及己糖激酶活性,极显著降低畸形率。总之,猪精液冷冻前添加浓度为0.10 mmol/L的他克林可能通过提高抗氧化能力和糖代谢水平改善冻融后猪精子的质量。