小鼠MSTN shRNA可控表达载体构建及基因沉默效率研究

肌肉生成抑制素(MSTN)是肌肉发育的负调控因子。根据MSTN mRNA序列设计1对MSTN shRNA并构建整合型四环素诱导表达MSTN shRNA载体pSingle-tTS-MSTN shRNA-GFP。重组载体转染小鼠成肌细胞并经G418筛选,通过强力霉素(DOX)诱导细胞中MSTN shRNA表达,利用荧光显微镜观察细胞中GFP表达情况,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot检测MSTN mRNA及蛋白的表达水平。结果表明:经DOX诱导后,转染含MSTN shRNA重组载体细胞组MSTN mRNA相对表达水平比未经DOX诱导组及其他对照组细胞中降低70%左右,差异极显著(P0.01),MSTN蛋白也下降90%左右,其他各组间MSTN mRNA及蛋白表达量差异不显著(P0.05)。该研究成功构建了可控表达MSTN shRNA载体,并在细胞水平证明其有很好的基因表达及调控效率,为后续制备可控表达MSTN shRNA转基因小鼠,通过精细调控MSTN基因的表达为研究该基因在肌肉发育中的功能奠定基础。     

肌肉生成抑制素(MSTN)基因及其在畜牧业上的应用

肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)是控制肌肉生长的负调控因子,属于TGF-β超家族成员,是影响畜禽瘦肉率、改善肉质性状的重要营养基因。文章主要对MSTN基因的结构、基因表达、生物学功能及其在畜禽生产中的应用进行综述。     

肌肉生成抑制素基因及其应用研究进展

肌肉生成抑制素（Myostatin,MSTN）是控制肌肉生长的负调控因子,是近些年研究发现的又一影响畜禽瘦肉率、改善肉质性状的重要营养基因.本文回顾了MSTN基因的基因结构、在畜禽中的表达、同源保守性等基础性研究成果,综述了近年来在人类以及畜禽生产中的应用研究进展,探讨了MSTN基因的应用前景.     

狮头鹅与乌鬃鹅Myostatin的序列和表达分析比较

Myostatin（MSTN）是调控肌肉生长发育的重要基因.本研究旨在分析该基因在广东地方鹅种狮头鹅和乌鬃鹅中序列和表达的差异.研究使用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技术克隆了两鹅种MSTN基因的ORF、5′和3′UTR序列,对序列进行生信分析,并对MSTN在两鹅种不同组织,及胚胎15、23 d和1 日龄的表达进行了检测. 结果发现,两鹅种MSTN基因的ORF区和3′UTR区DNA序列差异较小,5′UTR区差异较大,狮头鹅该区域存在35 bp DNA片段缺失. 两鹅种MSTN ORF区DNA和氨基酸序列与浙东白鹅、绿头野鸭和鸡一致性最高,DNA序列一致性在94.77%以上,氨基酸序列一致性在98.40%以上. MSTN在两鹅种1日龄的腿肌中特异高表达,在心、肝、脾、肺、肾和小肠中不表达或微量表达,在胚胎15 d到1日龄的腿肌中表达逐渐升高,自胚胎期23 d起,MSTN在乌鬃鹅中的表达显著高于狮头鹅.研究为进一步探究MSTN在两鹅种胚胎肌肉发育时期可能发挥的不同调控功能奠定了基础.     

小鼠MSTN shRNA设计及其活性检测

根据小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)mRNA序列设计4对shRNA序列,通过退火连接到shRNA过表达载体pGPU6/GFP/Neo,构建相应的过表达载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA。转染C2C12细胞后,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot试验对shRNA基因沉默后MSTN mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果表明:设计并构建的4个MSTN shRNA过表达载体,在细胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表达水平,其中转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714载体细胞组基因沉默效率最高,MSTN mRNA和蛋白表达分别下降72%、74%,差异极显著(P0.01)。该研究成功设计了4个MSTN shRNA序列并构建了相应的高效表达载体,为后续通过调控MSTN表达研究其在肌肉发育中功能奠定基础。     

朗德鹅MSTN基因外显子3多态性的研究

肌抑制素基因(MSTN)属于转化生长因子-β超家族成员,其主要功能是负向调控肌细胞生长发育。为检测朗德鹅MSTN外显子3多态性,采用PCR-SSCP的方法,对肌生成抑制基因外显子3进行了分析;结果发现,该片段存在PCR-SSCP多态性;对具DNA多态性的片段测序分析发现:MSTN基因外显子3第1 023处发生了单碱基的改变(A→G)。通过研究MSTN基因的多态性,为朗德鹅的选种和选育提供实验基础和理论依据。     

三个品种马MSTN基因PCR-SSCP多态性分析

[目的]肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)基因对肌肉起负调控作用.以MSTN基因作为候选基因,寻找影响马生长及运动性能等相关的单核苷酸多态性(SNP)位点,为马的分子育种提供一定的理论依据.[方法]以焉耆马、伊犁马、蒙古马3个品种采取的196个个体为材料,利用PCR-SSCP、DNA测序等技术,对马MSTN基因进行多态性分析.[结果]伊犁马、焉耆马MSTN基因检测到1个单核苷酸多态性位点(g.2115A→G),位于马MSTN基因的第一内含子区.通过PCR-SSCP分析检测到AA、AG和GG三种基因型,且处于Hardy-Weinberg非平衡状态.蒙古马中未检测到SNP位点.[结论]除蒙古马外,焉耆马与伊犁马MSTN基因检测到一个多态性位点.该基因可能对马运动性能具有重要影响作用.     

反向、巢式、降落PCR技术克隆奥尼罗非鱼MSTN基因3'侧翼序列

为获得奥尼罗非鱼侧翼MSTN基因的3'未知序列以完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆,采用反向、巢式、降落等3种PCR技术对该未知序列进行克隆,对克隆到的序列进行测序,并与已有的奥尼罗非鱼MSTN基因核苷酸序列进行比对,获得MSTN基因3'端1 376 bp新序列,从而完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆,为奥尼罗非鱼MSTN基因功能的进一步研究以及奥尼罗非鱼的分子育种研究奠定基础。说明反向、巢式、降落PCR相结合是扩增已知基因侧翼序列行之有效的方法。     

不同日粮氨基酸模型对吉林白鹅肌肉组织中MSTN mRNA表达量的影响

[目的]揭示肌肉生长抑制素与氨基酸营养的关系,为阐明鹅肌肉生长发育的调控机理提供依据。[方法]利用分子生物学技术克隆吉林白鹅MSTN基因,通过饲喂4种不同的日粮氨基酸模型研究不同日粮氨基酸模型对1~28日龄和29~56日龄的吉林白鹅MSTN基因表达量的影响。[结果]28 d,A组胸肌MSTN mRNA表达量极显著高于其他3组(P0.01),A组和C组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于B和D组(P0.05),在B组日粮氨基酸模型下胸肌和腿肌的MSTN mRNA表达量与胸肌率和腿肌率呈极显著负相关。56 d,A组和D组胸肌MSTN mRNA表达量显著高于B组和C组(P0.05),D组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于A、B、C组(P0.05),在C组日粮氨基酸模型下胸肌和腿肌MSTN mRNA表达量与胸肌率和腿肌率呈极显著负相关。[结论]28 d,日粮氨基酸模型B能够抑制MSTN基因的表达,而56 d日粮氨基酸模型C能够抑制MSTN基因的表达,并且MSTN基因表达量与胸肌率和腿肌率之间存在极显著负相关。     

贵州白山羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因生物信息学预测与系统进化分析

本研究旨在解析贵州白山羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因的结构特性,为该基因功能探究提供理论依据。基于生物信息学及比较基因组学方法,对NCBI数据库中已登录的贵州白山羊MSTN基因完整编码区序列(CDS)核苷酸组成特性及编码蛋白的相关结构开展预测及分析,构建了15个物种MSTN基因系统进化树。结果表明,贵州白山羊MSTN基因CDS长度为1 128bp,共编码375个氨基酸,由3个外显子和2个内含子构成,其AT含量均高于GC。贵州白山羊MSTN蛋白属混合型二级结构,存在无规则卷曲、延伸链和α-螺旋,为弱碱不稳定亲水蛋白质;包括1个18个氨基酸的潜在信号肽,无跨膜区,形成5对二硫键,含有16个磷酸化位点;278～375位氨基酸为转化生长因子-β样结构域。贵州白山羊MSTN基因与绵羊、牛等牛科动物的亲缘关系较近,与鸡形目原鸡和绿头野鸭的亲缘关系较远。本研究可为贵州白山羊MSTN基因分子遗传学及其表达调控研究奠定理论基础。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

关岭黄牛MSTN启动子真核报告载体的构建与启动活性研究

采用PCR 技术扩增牛MSTN 基因启子,亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建重组报告载体pGL3-Basic- MSTN-promoter。将重组报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter 与内参质粒pRL-TK 用脂质体法瞬时共转染小鼠成肌细胞系C2C12 和小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1,通过双荧光素酶活性检测其启动子活性遥测序结果表明,成功构建了牛MSTN 基因真核报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter,瞬时转染试验表明,pGL3-Basic-MSTN-promoter在C2C12细胞和3T3-L1 细胞中的启动子活性分别为pGL3-Basic空载体的14.53 倍尧5.02 倍。研究结果为进一步研究MSTN 基因的表达调控机制奠定了基础。     

畜禽肌肉生成抑制素基因多态性研究进展

肌肉生成抑制素属于TGFβ超家族成员,该基因功能缺失性突变的个体表现出肌纤维数量和直径显著增大,导致肌肉产量显著增加。总结了MSTN基因在鸡、猪、牛、羊上多态性的研究进展。     

贵州黑山羊肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及其蛋白抗原表位预测

为通过原核、真核外源表达贵州黑山羊肌肉生长抑制素(MSTN)蛋白,制备MSTN受体拮抗剂或免疫诱导山羊产生MSTN抗体,从而消除MSTN对肌肉生长的抑制作用奠定基础,采用RT-PCR技术扩增贵州黑山羊生长抑制素基因cDNA序列;应用生物信息学相关软件和方法对生长抑制素蛋白二级结构和抗原表位进行预测。结果表明:贵州黑山羊生长抑制素基因编码区全长1 128bp,编码375个氨基酸。生长抑制素蛋白二级结构以无规卷曲为主,有少量的α螺旋和β片层,少见β转角;推测生长抑制素蛋白在二级结构上可能有3个优势抗原表位区域,分别为72～78、235～240和251～254位肽段。     

Myostatin基因及其与动物双肌性状间关系的研究进展

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）又称生长分化因子8（growth differentiation factor 8,GDF-8）,属于转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF-β）超家族成员,由McPherron等在1997年筛选小鼠肌肉cDNA文库时首次发现。目前已研究过的不同哺乳物种间的MSTN基因结构均含３个外显子和２个内含子,且成熟肽氨基酸序列的差异均在3个以内。MSTN在多个组织中表达,包括心肌、脂肪、胎盘、乳腺、子宫、嗅觉神经细胞、肝、脾、肺和肾等,主要在骨骼肌中高水平表达。MSTN的成熟包括由信号肽酶、前蛋白转化酶Furin和金属蛋白酶BMP-1/tolloid家族的酶解和加工,成熟的MSTN为同质二聚体化。MSTN的最显著作用是作为骨骼肌的强有力的负调控因子,可通过自分泌或旁分泌的方式激活TGF-β、p38 MAPK、ERK1/2、和JNK等信号途径及抑制IGF-AKT和Wnt信号途径,协同抑制成肌细胞的增殖和分化。MSTN基因敲除小鼠的肌肉重量显著增加而表现为双肌性状,并可通过增强肌肉再生和降低纤维化的方式提高肌肉愈伤能力;糖的消耗和糖摄入加强,且对胰岛素的敏感性加强;心脏增大且压力应激增强;脂肪重量减轻,脂肪发生受到抑制,且白色脂肪组织的黄化加强而能够促进生热作用;骨密度和骨矿物质含量增强,并可增加骨折骨痂的尺寸和强度而促进骨折的愈合。MSTN还可通过调控胎盘的建立和葡萄糖的摄入、调控子宫平滑肌细胞和内膜上皮细胞的增殖及乳腺的发育,参与雌性哺乳动物的生殖调控。自然发生的MSTN基因功能缺失型纯合突变也能够引起动物表现双肌性状,已知的这些突变包括牛的p.D273RfsX13(也称nt821(del11))、p.C313Y、p.F140X(也称nt419(del7ins10))、p.Q204X、p.E226X和p.E291X突变, 绵羊的c.960delG(也称p.K320NfsX39)和c.120insA（也称p.N40MfsX9）突变,狗的c.939-940delTG突变和人类的c.373+5G＞A突变;此外在绵羊中还存在一个靶向MSTN基因的miRNA功能获得型纯合突变c.2360G＞A(也称g.6223G＞A)也可引起双肌性状。双肌动物在19世纪初就已记载,不仅表现有更多的肌肉,而且有更少的骨骼和脂肪,然而双肌性状也会带来一些缺点,包括产奶率下降、雌性繁殖力下降、难产增加和幼畜死亡率增加,因此运用基因工程技术合理优化MSTN功能的发挥且又降低双肌性状副作用的方法来培育优质肉用家畜品种一直是研究热点。在牛中还存１个保守性错义突变p.F94L,并不会改变MSTN的功能,所以不会发生双肌表型的副作用,但可引起肌肉重量增加,并降低肌内和肌外的脂肪含量,且不会影响肉嫩度,因此目前p.F94L突变已较理想地用于肉牛的分子标记育种。本文综述了哺乳动物MSTN基因的结构、表达、信号转导、生理功能、突变体、双肌表型和在家畜育种中的最新研究进展,旨在为更深入理解哺乳动物MSTN作用机理及为肉用家畜品种的培育提供参考。     

湖羊Myostain 和Myogenin基因表达的发育性变化及与屠宰性状的关联分析

 【目的】探讨湖羊肌肉生长抑制素(myostain,MSTN)和生肌调节因子(myogenin, MyoG)基因表达的发育性变化及其与屠宰性状的相关性以及这两个基因表达水平的关联性。【方法】利用RT-PCR分析MSTN和MyoG基因在湖羊早期生长背最长肌肉组织中的mRNA的发育性变化。【结果】湖羊MSTN基因在肌肉中的表达在2日龄时表达水平最低,并随着日龄增加而增加直到60日龄为止,而后随着年龄增加而下降。湖羊MyoG基因在2日龄时表达最低,在30日龄之前随着日龄的增加而增加,然后在30日龄后下降,公羊直到120日龄、母羊直到90日龄为止,然后随着日龄的增加而又增加。MSTN和MyoG基因在湖羊各生长阶段间大多存在显著或极显著差异。湖羊公羊与母羊MSTN和MyoG基因之间在各相同生长阶段间大多存在显著或极显著差异。MSTN和MyoG基因表达水平与宰前活重、胴体重和净肉重均呈正相关,但只有MSTN和净肉重呈显著正相关(0.01＜P＜0.05),MSTN基因和MyoG基因的表达存在极显著正相关(P＜0.01)。【结论】 性别和年龄对于MSTN和MyoG基因在湖羊肌肉中的表达具有重要影响。MSTN、MyoG基因在不同生长阶段的公羊和母羊中的表达模式相似。MSTN和MyoG基因在湖羊不同生长阶段的肌肉中的表达均没有出现随着日龄的增加而一直增加或下降的趋势。MSTN基因和MyoG基因在湖羊早期肌肉性状中的表达为正相关。     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究

[目的]研究MSTN基因在藏系绵羊不同年龄、不同组织的表达差异。[方法]根据GenBank已发表序列（NM_001009428．1）设计l对引物,以藏系绵羊组织总RNA为模板,采用实时荧光定量PCR技术（QRT—PCR）分析了MSTN基因在不同年龄阶段的真胃、瘤胃、腿肌和心肌中的基因表达量。[结果]经过内参基因校正后,综合4个组织分析,MSTN基因在6月龄藏系绵羊的相对表达量最高,是12月龄藏系绵羊的2．52倍,是羔羊的2．24倍,是9月龄的1．30倍（尸〈O．05）。且MSTN基因在腿肌中的表达量最高,在其他组织几乎未表达,在腿肌中的表达量是其瘤胃的3984．78倍,是心肌的602．69倍（P〈0．01）。[结论]为MSTN蛋白抗体的正确利用奠定了基础。