蜡状芽孢杆菌HY-1降解甲基对硫磷和毒死蜱的影响因素研究

采用富集驯化培养和紫外分光光度计定量的方法,从农药生产企业的废水处理系统中分离筛选出1株能够降解甲基对硫磷和毒死蜱的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)HY-1,并系统研究了影响其降解甲基对硫磷和毒死蜱的主要因素。研究表明,菌株HY-1能够利用甲基对硫磷和毒死蜱为唯一磷源降解农药。HY-1降解甲基对硫磷的适宜条件为:培养温度30～35℃,pH为6～8,甲基对硫磷初始浓度为10～50mg·L-1,接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到菌悬母液(OD600=3.0)的0.8～1倍),添加葡萄糖不能促进菌株对甲基对硫磷的降解。HY-1降解毒死蜱的适宜条件为:葡萄糖浓度6g·L-1,培养温度30～35℃,pH为7.0,毒死蜱初始浓度80～200mg·L-1,接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到菌悬母液(OD600=3.0)的0.8～1倍)。结果表明,HY-1菌株降解甲基对硫磷和毒死蜱的适宜条件相类似,只是降解所需的最适葡萄糖浓度和底物浓度不同。     

解毒酶降解甲基对硫磷的研究

为验证产碱假单胞菌代谢产生的解毒酶对农药的降解作用,研究了该酶对水体系和蔬菜中的甲基对硫磷的降解规律,同时采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析了酶作用后甲基对硫磷的降解产物。结果表明:此酶可以有效降解甲基对硫磷的残留,且酶浓度越高,其降解效果越好。当水体系中甲基对硫磷起始浓度为03 mg/L时,添加320 mg/L的酶作用90 min后,甲基对硫磷的降解效果可达81.7%;当蔬菜体系中甲基对硫磷浓度为0.5 mg/kg时,添加相同量的酶作用60 min后,甲基对硫磷的降解效果可达58.5%。通过GC-MS确定降解产物为4-硝基酚,水体系中甲基对硫磷的降解规律符合一级反应动力学模型(R2>0.84),这为促进其在实际生产中的应用提供理论依据。     

通过正交实验设计突变体组合提高甲基对硫磷水解酶OPHC2对乙基对硫磷的降解能力

分别自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1)和假单胞菌（Pseudomonas sp. 1-7）中克隆得到甲基对硫磷水解酶基因ophc2和ophc3,其编码甲基对硫磷水解酶OPHC2和OPHC3的氨基酸序列相似性达98.5%,仅5个氨基酸残基不同,但酶学性质差异很大,特别是对不同底物降解特性有很大差异。OPHC2对甲基对硫磷的催化效率是OPHC3的2.75倍,对乙基对硫磷的催化效率仅为OPHC3的12.9%。为了提高OPHC2对乙基对硫磷的降解活性,以OPHC3的序列为依据,针对5个不同的氨基酸设计正交实验,对OPHC2进行组合突变,最终获得了一个突变体P165S/A169V,对乙基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.19倍,对甲基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.36倍。     

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药,常被用作菜农用作杀虫剂,有机磷水解酶可通过切断甲基对硫磷中的■键实现对甲基对硫磷的快速、高效降解。通过对有机磷水解酶降解条件进行优化,得到有机磷水解酶最优的农药降解条件:酶浓度为1∶1 000、pH值为8、降解温度为37℃、降解时间为10 min。通过气相色谱法测得有机磷水解酶对1、5、10μg/mL甲基对硫磷的降解率均达到98%以上,因此在生产中有机磷水解酶可作为针对甲基对硫磷的高效快速降解酶进行推广使用。     

毒死蜱降解菌的驯化筛选及高活性毒死蜱降解菌群的构建

[目的]通过对3种活性污泥的长期驯化、微生物多样性分析及优势菌筛选与复配,构建一种对毒死蜱具有高降解活性的菌群.[方法]以农药公司的3种不同废水处理工序的污泥为材料,利用毒死蜱长期胁迫驯化以获得高效降解毒死蜱的活性污泥;随后,在驯化后的3种活性污泥中筛选优势菌株,并以筛选的菌株构建复合菌群用于毒死蜱的降解.[结果]以毒死蜱为碳源,在驯化后的活性污泥中筛选到3株具有毒死蜱降解活性的菌株(Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2、Serratia MLCs-1),并对3种菌株进行复配,构建了复合菌群MLCF7.复合菌群MLCF7对100 mg/L毒死蜱降解率达82.84％.[结论]复合菌群对毒死蜱具有高降解活性,表明其在农药污染生物修复中具有应用潜力.     

节杆菌与施氏假单胞菌对甲基对硫磷的共降解研究

为实现对有机磷农药甲基对硫磷的彻底降解,研究利用有机磷农药降解菌施氏假单胞菌YC-YH1与对硝基苯酚降解菌CN2对甲基对硫磷进行共降解试验,同时克隆了参与降解过程的相关基因,并对2株菌株在对甲基对硫磷污染土壤的原位修复中的效果进行研究。结果表明,与YC-YH1单独降解相比,YC-YH1和CN2共降解在处理前32 h无较大差异;但之后,甲基对硫磷和对硝基苯酚的降解速度明显加快,处理48 h后甲基对硫磷即被完全降解,比单独用YC-H1降解时提前了16 h,处理64 h时对硝基苯酚就被完全降解。而土壤修复的研究结果表明,菌株YC-YH1与CN2能够高效降解甲基对硫磷,72 h对土壤中100 mg/kg甲基对硫磷的降解率接近100%,尤以未灭菌土壤中降解效果更好。     

6种酶抑制-比色法快速检测试剂盒对4种有机磷农药的敏感性

为商品化酶抑制-比色法快速检测试剂盒的选择提供依据,采用6种商品化酶抑制-比色法快速检测试剂盒对甲胺磷、毒死蜱 、甲基对硫磷、三唑磷进行5个浓度水平的检测比对试验,比较各试剂盒对4种农药的灵敏度。结果表明：6种试剂盒对4种农药的灵敏度均不同,测试时取用3mL的提取液和取用2.5mL的提取液根据农药的不同和试剂盒的不同存在一定差异。6种试剂盒测定甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷、和三唑磷的半抑制浓度均大于3mg/kg,大于国家限量标准的规定（甲胺磷0.1mg/kg、毒死蜱1mg/kg、甲基对硫磷0.02mg/kg、三唑磷0.1mg/kg）,建议在实际的检测工作中对抑制率≥10%的样品进行复检,同时上色谱质谱进行定性定量。     

一株有机磷农药降解菌的分离、鉴定及降解酶基因的克隆

从农药厂污水处理池中分离到一株能很好降解甲基对硫磷和对硝基苯酚的菌株Yw18,它能以甲基对硫磷或对硝基苯酚为惟一碳源生长,经鉴定,为苍白杆菌(Ochrobacterumsp.)。用气相色谱法和分光光度法对Yw18的降解性能进行了研究,结果表明,在0.5 h内它对50 mg.L-1甲基对硫磷的降解率达90%以上,在8 h内能将50 mg.L-1对硝基苯酚完全降解。对该菌进行了系统发育研究,并用PCR法克隆其甲基对硫磷降解酶基因mpd。     

一株有机磷农药降解菌的分离、鉴定及降解酶基因的克隆

从农药厂污水处理池中分离到一株能很好降解甲基对硫磷和对硝基苯酚的菌株Yw18,它能以甲基对硫磷或对硝基苯酚为惟一碳源生长,经鉴定,为苍白杆菌(Ochrobacterumsp.)。用气相色谱法和分光光度法对Yw18的降解性能进行了研究,结果表明,在0.5 h内它对50 mg.L-1甲基对硫磷的降解率达90%以上,在8 h内能将50 mg.L-1对硝基苯酚完全降解。对该菌进行了系统发育研究,并用PCR法克隆其甲基对硫磷降解酶基因mpd。     

来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定

通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。 doi1基因在E. coli BL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。     

施氏假单胞菌YC-YH1对甲基对硫磷的降解及其代谢产物检测

利用实验室已获取的菌株YC-YH1对甲基对硫磷进行降解,以高效液相色谱结合质谱分析(HPLC-MS)测定菌株YC-YH1对甲基对硫磷的降解速率并检测其代谢产物,通过基因克隆研究菌株YC-YH1对甲基对硫磷降解的分子机制,同时分析代谢产物对菌株YC-YH1生长的影响.结果表明,菌株YC-YH1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),能够高效降解甲基对硫磷,其同时含有甲基对硫磷水解酶基因mpd和有机磷水解酶基因ophC2.经质谱分析确定,菌株YC-YH1将甲基对硫磷水解为对硝基苯酚和二甲基硫代硫酸酯,其中对硝基苯酚显著抑制YC-YH1的生长.综上,施氏假单胞菌YC-YH1能够高效地降解甲基对硫磷,但对硝基苯酚作为其代谢产物对YC-YH1的生长存在显著抑制作用.     

4种鱼类肝脏细胞色素P450对毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷的脱硫代谢

以毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷为供试农药,以斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼为供试生物,研究了3种农药对4种鱼的急性毒性,4种鱼肝细胞色素P450对3种农药的脱硫代谢作用及两者之间的相关性。结果表明,毒死蜱对于上述4种鱼的96hLC50分别为1.94、0.171、0.0273、0.0681mg·L-1;对硫磷为2.6、0.0559、1.78、1.02mg·L-1;马拉硫磷为7.07、0.907、6.03、0.172mg·L-1。4种鱼肝脏P450对于毒死蜱代谢的Vmax/Km值分别为1.67×104、2×104、5×104、2×104min-1;对于对硫磷代谢的Vmax/Km值分别为2×104、5×105、1.11×105、1.43×105min-1;对于马拉硫磷的值分别为5×103、5×104、2.5×103、1.67×104min-1。96hLC50值与Vmax/Km值大体呈负相关,其中毒死蜱的相关性较弱,对硫磷及马拉硫磷的相关性较强(R2值分别为0.2181、0.8490、0.5102)。研究结果说明P450在鱼类耐药性形成过程中发挥了阻碍作用。     

组合突变提高甲基对硫磷水解酶MPH热稳定性的研究

来源于苍白杆菌Ochrobactrum sp.M231的甲基对硫磷水解酶MPH-Och具有优良的催化水解甲基对硫磷农药的能力,针对其热稳定性较差的缺点,通过组合3种提高蛋白热稳定性的突变策略,最终获得热稳定性改良的突变酶MPHM7,其T50达到65℃,在之前研究热稳定性提高的四点突变酶(S274Q/T183E/K197L/S192M)的基础上又提高了5℃。同时,该突变酶的催化效率也获得了一定的提高,其kcat/Km值是四点突变酶的3.8倍。热稳定性改良突变酶的获得证实了这些提高热稳定性的方法是有效的,并且其作用具有加合性,这为分子设计改良酶蛋白热稳定性提供了新的研究思路。     

储藏和加工方式对稻谷中毒死蜱和三唑磷残留量的影响

[目的]了解稻谷加工方式和储藏方式对稻米中毒死蜱和三唑磷残留动态的影响机制。[方法]采用液相色谱-三重四极杆质谱法同时检测稻米中的毒死蜱及其代谢物3,5,6-三氯-2-吡啶酚(3,5,6-Trichloro-2-pyridinol,TCP)和三唑磷残留,分析碾磨、蒸煮、发芽加工以及储藏温度(37和4℃)对毒死蜱和三唑磷残留量的影响。[结果]毒死蜱及其代谢物TCP、三唑磷等农药残留多数分布在米糠层;短时间的蒸煮无法明显降低稻谷中毒死蜱的残留量;发芽稻谷中毒死蜱及其代谢物TCP、三唑磷的残留量显著低于未发芽稻谷;在37℃储藏条件下,毒死蜱的降解方程为C=0.899e~(-0.005t)(R~2=0.855 6),半衰期为138.6 d;三唑磷降解方程C=0.768e-0.009t(R~2=0.822 8),半衰期77.0 d,近似满足一级动力学模型方程;在4℃低温储藏条件下,稻谷中毒死蜱和三唑磷的残留量变化不大。[结论]碾磨和发芽加工有利于降低稻谷的农药残留量,低温储藏稻谷不利于残留农药的降解。研究可为稻米加工过程的风险评估以及开发稻米中农药残留的消解技术提供参考。     

滴灌条件下毒死蜱在土层中迁移转化规律及其对土壤微生物特性的影响

为了解滴灌条件下毒死蜱在土壤中的迁移转化规律,采用土柱模拟试验,研究了滴灌条件下种植作物、代森锌消毒和不同土壤含水率对毒死蜱的分布及土壤酶活性和土壤微生物生物量碳的影响。结果表明：施用于表层的毒死蜱在施用初期主要残留在10 cm以上土层,随着时间的增加,而发生降解并向下迁移。土壤中3,5,6-三氯-2-吡啶酚（TCP,毒死蜱的主要代谢产物）含量在0.1~1.5 mg·kg^-1之间,施药30 d后,40 cm土层中毒死蜱和TCP均有检出。不同处理下,毒死蜱含量在10 cm以上土层存在较大差异,TCP含量在20 cm以上土层存在一定差异。消毒抑制毒死蜱的降解,作物根系促进土壤微生物繁殖,有利于毒死蜱的降解。土壤含水率对10 cm土层毒死蜱含量有较大影响,在未消毒和种植作物处理中,最强的毒死蜱降解分别发生在土壤含水率为80%和70%处理中。毒死蜱和TCP对微生物以抑制作用为主,不同处理的抑制程度不同。毒死蜱在低浓度时对过氧化氢酶和脲酶活性有激活作用,高浓度时存在抑制作用,作物的存在减弱了毒死蜱对两种酶活性的影响。毒死蜱的降解与土壤碱性磷酸酶活性有关,种植作物改变了毒死蜱和土壤碱性磷酸酶的分布。代森锌消毒对过氧化氢酶和脲酶活性有激活作用,对碱性磷酸酶活性有一定抑制作用。     

对硫磷在油菜不同生育期上的残留和降解动态分析

采用气相色谱法测定不同生长期油菜中对硫磷的残留和降解动态情况。试验结果表明,以体积浓度为800mL/L的对硫磷处理苗期、抽薹期和花期三个生长时期的油菜,得出对硫磷在油菜上的残留半衰期为23.05~25.85h,在施药120 h后对硫磷在油菜上三个时期的消解率均达到90%以上,三个不同生育时期中对硫磷的消解规律无显著差异。     

两种叶菜类蔬菜对毒死蜱的吸收转移规律

采用水培方法,研究了毒死蜱对两种叶菜类蔬菜菠菜和生菜生长的影响、在不同培养液中的降解速度以及在蔬菜中的吸收和转移规律。结果表明,低浓度毒死蜱(1.0和10.0mg·L-1)对两种供试蔬菜的生长没有明显影响,但高浓度毒死蜱(100.0mg·L-1)对两种蔬菜的生长均有一定的影响,而且生菜对毒死蜱较菠菜更为敏感。两种蔬菜均能明显促进毒死蜱在溶液中的降解,在不同溶液中的降解速度如下:菠菜-培养液>生菜-培养液>塘水>培养液。两种供试蔬菜对毒死蜱均有很强的吸收能力,而且具有相似的吸收规律。毒死蜱在菠菜根中达到最大吸收值所需的时间比生菜根所需的时间短,但在茎和叶中所需的时间两种蔬菜相同。     

鼠李糖脂-混合降解菌强化三角梅去除土壤中对硫磷

在温室盆栽条件下,通过单独或联合添加生物表面活性剂鼠李糖脂(RH)和接种混合降解菌(DB),研究了生物表面活性剂-微生物对三角梅修复对硫磷污染土壤的强化效果。结果表明,添加鼠李糖脂和接种混合降解菌可以促进三角梅的生长,特别是对植物根部促进作用显著(P0.05),而种植三角梅使土壤中对硫磷的去除率提高了1.6倍。添加鼠李糖脂、接种混合降解菌可以促进三角梅对土壤中对硫磷的去除,50 d后去除率分别达到73.01%和77.13%,高于对照组(63.23%);两者的联合作用使土壤中对硫磷的去除率达到91.96%。三角梅从土壤中吸收的对硫磷主要积累于根部,对照组中三角梅地上部、根部对硫磷的积累量分别达到153.59、289.57μg·g~(-1),添加鼠李糖脂、接种混合降解菌显著降低了三角梅体内的对硫磷积累量(P0.05)。同时发现,三角梅的存在显著提高了土壤脲酶、过氧化氢酶和碱性磷酸酶活性(P0.05),添加鼠李糖脂和接种混合降解菌可以在不同程度上提高土壤中酶的活性。     

毒死蜱主要代谢物3,5,6-TCP在土壤、植物中的累积与转化

本研究应用盆栽试验和室内土壤培养试验,考察毒死蜱主要代谢物3,5,6-三氯-2-吡啶(简称3,5,6-TCP)在植物、土壤中的累积与转化,研究毒死蜱代谢产物累积量变过程及其影响因素。结果表明:(1)推荐剂量喷施毒死蜱的第7天和第14天,3,5,6-TCP在植物体和土壤中的累积量达到峰值,直到20d后,植物体内几乎测不出3,5,6-TCP残留,而土壤中3,5,6-TCP残留量仍较高,其降解速度较慢。(2)3,5,6-TCP在5种土壤中的累积量主要与土壤自身物理性质有关,并随着温度和施用量的增加而增加,与施肥量和湿度相关不大,5种土壤中3,5,6-TCP的残留累积量在0.14～0.21μg/g。(3)在厌氧条件下培养土壤样品,应用色谱保留时间验证3,5,6-TCP在土壤中能继续转化生成3,5,6-三氯-2甲氧基吡啶(TMP),表明毒死蜱代谢转化途径与微生物量及种类有关,使得毒死蜱的安全降解具有可行性。