复方中药提取物对REV诱发的免疫抑制鸡的免疫增强作用

 【目的】探讨复方中药提取物对REV诱发的免疫抑制鸡的免疫增强作用,建立测试某些中药制剂免疫增强作用的实验模型。【方法】分别在临床健康鸡和在1日龄感染网状内皮增生病病毒（REV）诱发了免疫抑制状态的鸡测试了中药制剂对鸡的免疫增强作用。【结果】随饮水饲喂黄芪、党参、淫羊藿和甘草复方中药浸出物,在健康鸡对鸡新城疫病毒（NDV）和H5亚型禽流感病毒（H5-AIV）灭活疫苗免疫后的血凝抑制（HI）抗体滴度没有明显影响。但是在REV诱发了免疫抑制的鸡,该中药浸出物可显著提高对NDV和H5-AIV的HI抗体滴度（P＜0.01）,虽然仍显著低于未经REV感染的对照鸡。【结论】REV诱发的免疫抑制状态下的鸡,可作为测试某些中药制剂免疫增强作用的一种实验模型。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种发生于禽类的病毒性传染病。笔者以杂交瘤技术研制抗AIV共同抗原的特异单克隆抗体，旨在建立一种双抗体夹心ELISA方法快速检测AIV，以便为A型AIV的快速诊断技术的研究提供理论依据。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究（英文）

Five monoclonal antibodies(Mabs)to nuclear protein of avain influenza virus(AIV)were developed by syncretizing SP 2/0 and the spleen cells from BALB of mice immuized with H9 subtype AIV.Specificity of these Mabs were identified by immunofluorescent assay(IFA)and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).These five Mabs which were named as AIV-NP-2C3,AIV-NP-6A5,AIV-NP-3H9,AIV-NP-7B4,AIV-NP-2H4 could react with all viruses of AIV-H9 strains in tests.The result of Western blotting showed that only the 60 ku protein antigen of AIV-H9 could be recognized by the Mabs but never recognized by New castle disease virus,REV and infectious bursa disease virus.The result of preliminary application showed that avian influenza viruses could be dectected by Mabs in IFA and ELISA.All these Mabs will probably play important roles in preventing and monitoring avian influenza viruses.     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

利用禽流感H9亚型病毒(AIV-H9)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经免疫荧光试验(IFA)检测,以研制抗禽流感病毒(AIV)单克隆抗体。结果获得了5株特异性抗AIV核蛋白(NP)的单克隆抗体细胞株,分别命名为AIV-NP-2C3、AIV-NP-6A5、AIV-NP-3H9、AIV-NP-7B4、AIV-NP-2H4。这5株单克隆抗体能与所有试验的AIV-H9病毒反应,Western blotting方法鉴定结果表明,单克隆抗体仅识别60 ku的蛋白抗原,而不与新城疫病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、传染性法氏囊病毒等反应。初步应用结果显示,以这些单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验或ELISA方法可迅速检测出禽流感病毒,这些单克隆抗体在禽流感的预防监测中将发挥重要的作用。     

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒（NDV）融合蛋白和禽流感病毒（AIV）核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156bp和219bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT—PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H;亚型AIV的最低病毒量分别为10^3.7EID。和10^3.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT—PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV．感染的快速鉴别。     

禽网状内皮组织增殖病病毒感染鸡的外周血白细胞动态变化

３２只１日龄ＳＰＦ鸡随机分为３个试验组和１个对照组。试验组分别腹腔接种３株禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ－Ｔ、ＲＥＶ－ＤＩＡ和ＲＥＶ－Ｃ４５）,０．５ｍＬ／羽;对照组注射等量生理盐水。在不同时期检测感染鸡外周血白细胞数的动态变化。结果发现,各试验组鸡的白细胞总数和异嗜性白细胞百分率及总数均呈先升高后降低的趋势;淋巴细胞百分率先降低后升高,而淋巴细胞总数则在接种后第３天显著（Ｐ＜０．０１）高于对照组,第１０天起则显著低于对照组。各试验组间白细胞数的变化不尽相同。     

中药制剂SHY对新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒的抑制和攻毒保护效果

本试验利用蔷薇科植物提取物（SHY）分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用.结果表明：SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活（6/8）,病毒分离阳性.在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5/5、5/5、5/5和4/5.显示SHY不但能显著抑制新城疫、禽流感H9和H5亚型在鸡胚上增殖,而且能保护新城疫、禽流感H9亚型病毒的攻击.对SHY深入的研究,有望开发出有效抗禽流感药物.     

抗禽流感、新城疫、法氏囊三联高免卵黄抗体的研制及应用

采用免疫学技术将禽流感(AI)、新城疫(ND)和传染性法氏囊(IBD)疫苗多次免疫产蛋鸡,获得高免蛋,并制成AI-ND-IBD三联高免卵黄抗体液,应用HI和AGP等血清学方法测定AI、IBD及ND抗体滴度。结果证明:AI,HI和IBD,AGP抗体滴度为1 : 128～1 : 512,ND,HI抗体滴度为1 : 256～1 : 1 024,在发病初期给病鸡肌注高免卵黄液,总有效率达89 %。该抗体液制作简单,价格低廉,效果可靠。     

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒（AIV）抗原的双抗体夹心ELISA方法。经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件：兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1：8000（浓度为3.531μg/ml）,抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1：800,酶标二抗的工作浓度为1：4000。与其他禽易感病毒（NDV、IBV、EDS-76V）等均没有交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查。     

番鸭中网状内皮组织增生症病毒感染的检测

网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)是一种可感染多品种禽的免疫抑制病病原,禽类感染REV后会导致机体发生免疫抑制并由此引发多种病原的继发感染(或混合感染),给养禽业造成极大损失。本研究利用针对REV基因组长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)的特异性引物,对21份2013年收集的福建(12份)和浙江(9份)两省的番鸭源病料(肝脏和脾脏组织)进行检测。其中来源于福建漳州(1株,记为REV-FJ-MD01)和浙江宁波(1株,记为REV-ZJ-MD01)的番鸭源病料检测到REV感染阳性。将目的片段经克隆后进行序列测定分析发现,REV-FJ-MD01和REV-ZJ-MD01在该扩增区域的核苷酸同源性为100%,与GenBank中的REV参考株(除鸽源REV和鸭源713株仅1个碱基差异外)核苷酸同源性也为100%;从遗传进化关系可以看出,REV-FJ-MD01和REV-ZJ-MD01与REV参考株遗传进化较近,处于相同的遗传进化分支。本研究首次证实在福建番鸭中存在REV感染。     

Mab-ELISA对IBV毒株定性检测方法

针对禽传染性支气管炎病毒（IBV）血清型众多、临床检测不易的难题，用我国自已研制的2株IBV单克隆体，通过多种方法的比较与鉴定，建立起活用于定性检测IBV的包被鼠源IBV单抗的Mab-ELISA方法，其操作程序是：包被鼠源IBV单抗－被检测病毒－鸡抗IBV高免血清－兔抗鸡IgG(AGP效价1：32）－羊抗兔IgG-HRP;用本方法对国内46个IBV分离株及NDV、AIV－H9N2、PPMV－I等的检测，表明其具有较好的特异性和敏感性。     

应用非脂佐剂提高鸡新城疫(ND)Ⅱ系弱毒疫苗效力的研究

2,4日龄雏鸡接种非脂佐剂苗进行首免后,HI抗体滴度的升高不受母源抗体的干扰,注射该苗雏鸡的HI抗体滴度极显著地高于Ⅱ系苗接种组(p>0.01);HI抗体滴度下降至有效滴度以下的时间也优于Ⅱ系苗组。人工感染IBD造成免疫缺陷的雏鸡接种非脂佐剂苗,能够使其HI抗体滴度达到健康雏鸡单独应用Ⅱ系苗的水平(p>0.05)。非脂佐剂苗的保护力明显高于Ⅱ系苗(p>0.05),并且非脂佐剂苗具有Ⅱ系苗同样的安全性。当母源抗体降为零或给雏鸡二免时,非脂佐剂苗无明显提高HI滴度的作用,与Ⅱ系苗组相比较,差异不显著(P>0.05)。非脂佐剂苗免疫雏鸡和Ⅱ系苗免疫雏鸡具有相同的细胞免疫水平(p>0.05)。     

重组鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活苗的免疫增强作用

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ,ChIFN-γ)对禽流感灭活疫苗的免疫增强效果,使用重组鸡γ-干扰素作为免疫佐剂,联合禽流感灭活疫苗采用胸部肌肉注射的方式免疫SPF雏鸡,免疫后每周测定血清抗体效价、免疫器官T、B淋巴细胞转化水平,攻毒后计算攻毒保护率。结果表明,鸡γ-干扰素提高了血清抗体水平,免疫器官T、B淋巴细胞转化水平和攻毒保护率,与疫苗组相比多数指标差异显著(P0.05)。鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。     

新-法二联灭活疫苗免疫不同日龄商品蛋鸡的效果

为探讨新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗(ND-IBD二联灭活苗)对不同日龄商品蛋鸡的免疫效果,选择360只1日龄商品蛋鸡,分别于1、7日龄接种ND-IBD二联灭活苗,对照组接种灭菌生理盐水,分别于21-56日龄,每隔7d采血,分离血清,检测ND和IBD抗体水平,剖检取脾脏与法氏囊观察病变,荧光定量PCR检测免疫因子CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量,并进行攻毒保护试验。结果表明,1、7日龄商品蛋鸡接种ND-IBD二联灭活苗,其ND和IBD的抗体水平均有效提高,且在免疫后可以有效保护IBDV强毒的感染,但7日龄免疫效果更好。免疫因子的mRNA表达量检测结果表明,7日龄接种疫苗的免疫组免疫因子CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量明显高于对照组1日龄。综上,ND-IBD二联灭活疫苗7日龄免疫商品蛋鸡免疫效果更好。     

家禽密切接触人群禽流感和新城疫血清学调查

为了评估家禽密切接触人群感染新城疫和禽流感病毒的风险,分别采集21份规模化养禽场和20份从事禽产品加工的屠宰场工作人员血清样品,采用微量中和试验检测人血清样品中新城疫和禽流感(H5和H9亚型)病毒抗体。结果发现,养禽场工作人员新城疫病毒抗体阳性率为33.3%,禽流感(H5和H9亚型)病毒抗体均为阴性;屠宰场工作人员新城疫病毒抗体阳性率为5%,禽流感(H5和H9亚型)病毒抗体均为阴性。结果表明新城疫病毒能够感染人,而目前国内流行的禽流感病毒感染人群的可能性较小。但是,由于禽流感病毒很容易发生变异和持续进化,有必要对家禽密切接触人群进行血清学监测。     

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。     

不同佐剂的新城疫疫苗免疫效果的研究

为评价不同佐剂的新城疫(newcastle disease,ND)灭活疫苗对鸡的免疫效果,选用铝胶佐剂、国产油佐剂及进口油佐剂与新城疫病毒抗原混合制成疫苗,免疫雏鸡,探讨不同佐剂的疫苗对鸡的安全性、新城疫的HI抗体水平及攻毒保护率。结果表明,3种佐剂的疫苗注射部位无不良反应;28天时HI抗体分别为28.2、28.5和28.8;56天时HI抗体分别为27.4、28.8和29.2,攻毒后的保护率分别为90%、100%和100%,铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗以及对照组攻毒后肛棉拭子NDV阳性率分别为10%、0、0及100%。用进口油佐剂配制的疫苗可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体产生的效价高、维持的时间长,其效果优于其它佐剂,有望成为ND灭活疫苗的候选佐剂。     

Dynamic Pathology and Antigen Location Study on Broiler Breeders with Coinfection of Marek''s Disease Virus and Reticuloendotheliosis Virus

To further understand the generation and development of coinfection of Marek's disease virus (MDV) and reticuloendotheliosis virus (REV) in broiler breeders, and then find the method and optimal time of differential diagnosis for complex clinic multiple infection, the authors studied the pathohistological changes, apoptosis, immunohistochemistry (immunofluorescence), and ultrastrueture of tumor tissues of broiler breeders inoculated with MDV and REV. The study showed that proliferation of small lymphocytes was seen in the main organs at the age of 1 week, then immature lymphocytes, all kinds of lymphocytes, primitive reticulum cells, and Marek's disease cells (MDCs) were observed at 2-9 weeks. Apoptosis of lymphocytes could not be seen until the age of 10 weeks in the immune system. Immunohistochemistry detection showed that the positive signs of MDV and REV antigen were observed in the main organs at 2 weeks of age. Multi-morphology lymphocytes, MDV, and REV, mitotic figures and apoptosis of lymphocytes were observed with the help of transmission electron microscopy. MDV cooperating with REV promotes the course of disease of coinfection. Differential diagnosis can be done by immunohistochemistry in the early stage (before 2 weeks), and histopathology in the late stage (post 4 weeks). MDCs, primitive reticulum cells, immature lymphocytes, and two kinds of virions can serve as a basis for histopathology differential diagnosis.     

新城疫单抗酶联试剂盒对鸡群中强毒感染的监测试验

用新城疫(ND)单抗酶联试剂盒检测从疑有新城疫病毒强毒感染的鸡群中采集泄殖腔棉拭样品68份,检出阳性20份。随机对其中15份样品进行病毒分离,结果阳性符合率为100％(15/15)。结果表明,该试剂盒特异性强,灵敏度高,诊断快速,易于基层推广应用。为ND的确诊和免疫鸡群中NDV强毒感染的监测提供了新方法。