巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

胡萝卜软腐欧文氏菌分子检测技术的研究

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Erwinia carotovora subsp.carotovora(Ecc)是引起魔芋和马蹄莲软腐病的主要病原细菌.本研究根据细菌L-氨基酸渗透酶同源基因设计URP核苷酸序列特异性引物进行普通PCR、巢式PCR,同时采用细菌16S-23S rI)NA间的ITS序列设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR,对样品中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌进行检测,并比较了3种检测方法的特异性和灵敏度.结果表明,应用实时荧光PCR方法检测样品,其中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌的最低菌悬液浓度可达10 cfu/mL;巢式PCR灵敏度也可检测到10 cfu/mL;而用普通PCR最低可检测到103 cfu/mL.用实时荧光PCR和巢式PCR方法榆测病菌,其灵敏度都比常规PCR提高了100倍,且实时荧光PCR方法更快速、简便、安全、准确,不需PCR的后续处理.实时荧光PCR方法适用于种苗、种球等检测领域.     

梨轮纹病和炭疽病病原菌PCR检测

为建立梨轮纹病原菌和炭疽病病原菌的分子检测方法,根据GenBank上炭疽病原菌和轮纹病原菌不同种的ITS序列差异设计2对引物TJ1/TJ2和LW1/LW2,对2种病原菌菌株进行扩增,比较了常规PCR和巢式PCR的检测灵敏度,并对果园中接种梨轮纹病原菌的梨果实进行检测。结果表明,建立的PCR体系可分别从炭疽病原菌和轮纹病原菌菌株扩增出317 bp和325 bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带。巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍,且可以在接种较低浓度(1 ml 10个)轮纹病原菌孢子液7 d后的梨果实组织中检测到病原菌。说明使用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病原菌在果园的种群消长动态。     

ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用

近年来 ,利用 PCR扩增病原菌核糖体 ITS( internal transcribed spacer)基因区段进行病原菌鉴定、检测及病害诊断技术得到了发展 ,利用病原菌在 r DNA的 ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性 ,对 ITS区进行 PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来诊断和检测植物病原菌 ,尤其是植物病原真菌的分子检测已越来越被广泛应用。     

萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种的实时荧光定量PCR检测

依据萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfacienspv.beticola)的16S~23S rRNA间隔区ITS序列,设计引物CfbF/CfbR。PCR扩增3个糖甜菜叶斑菌及29个参比菌株,仅靶标菌扩增出191 bp产物。用SYRB Green I荧光染料进行实时荧光定量PCR检测,制作标准曲线,回归直线决定系数R2为0.99。整个检测过程操作便捷,仅需2 h,可灵敏、特异、定量地对该病原菌进行检测。     

马铃薯炭疽病菌分离与鉴定

[目的]对进境船舶上携带的带病马铃薯薯块进行了病原真菌的分离鉴定,明确其检疫重要性,并对病菌的快速鉴定方法进行研究。[方法]通过形态学观察和ITS序列分析对病菌进行了鉴定,并对已有的巢式PCR方法进行了验证。[结果]形态学观察和ITS序列分析表明,病原菌为球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）。巢式PCR中用特异性引物Cc1NF1/Cc2NR1扩增C.coccodes得到了349bp特异性条带。[结论]巢式PCR方法可以用来对C.coccodes进行快速鉴定,该病原菌是进境植物检疫潜在危险性病原真菌,在国内口岸属首次截获。     

一种快速、特异性检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata）的巢式 PCR 方法

为建立检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata ）的方法,从河南省小麦黑胚籽粒上分离得到7个优势 A．alternata 病原菌株,对其 rDNA 的内部转录间隔区序列（ITS）进行测序,序列比较表明,分离到的病原菌株与 GenBank 公布的 A．alternata 的 ITS 区序列一致性达到99％～100％。根据 Alternaria 属菌株（A．alternata、A．tenuis、A．tenuissima）和麦类根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana ）的 ITS 序列比对结果,设计出1对 A．alternata 特异性引物 Aa1F/Aa1R。利用多种河南省小麦的主要病原真菌对该引物的特异性进行验证,只有在 A．alternata 中能特异性地扩增出1条443 bp 的 DNA 片段。以真菌通用引物 ITS1/ITS4为外侧引物、特异性引物Aa1F/Aa1R 为内侧引物进行巢式 PCR 扩增,能检测到 A．alternata DNA 的最低质量浓度为50 pg/μL。因此,建立的巢式 PCR 方法能够快速、特异地检测小麦中的 A．alternata。     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢杆菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16S rDNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905 bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16Sr DNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在自然界中广泛存在,而且大部分菌株能产生肠毒素和呕吐毒素,是引起养殖动物中毒的常见致病菌。在饲料生产过程中,为对该病原菌进行有效监控,以蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(entFM)和肠毒素T基因(bceT)保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计两对特异性引物,建立一种基于实时荧光PCR (real-time PCR)技术的蜡样芽孢杆菌快速检测方法,并对所建立方法的重复性、特异性及灵敏度进行分析。结果表明:所设计的引物可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测而且具有较高的重复性;对8株蜡样芽孢杆菌和8株非蜡样芽孢杆菌共16株菌株进行特异性检测,8株蜡样芽孢杆菌检测全部为阳性,8株非蜡样芽孢杆菌检测全部为阴性,无漏检和误检现象;对纯培养条件下蜡样芽孢杆菌提取的DNA模板进行10倍梯度稀释并进行灵敏度检测,两种肠毒素基因的检测限均为1.0×10~4CFU·mL~(-1);对人工染菌的饲料样品进行检测,在增菌18～20h后进行实时荧光PCR检测,检测限均可达到10CFU·mL~(-1),证明该方法具有良好的特异性和灵敏度,是快速检测饲料中蜡样芽孢杆菌的有效方法。     

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的快速分子检测

为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。     

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的快速分子检测

为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。     

检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测

向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害.针对这2种致病菌,目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究,但未见有2种病原菌同步分子检测的报道.本研究首先通过培养,观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征.发现前者菌落絮状,分生孢子器深褐球型,分生孢子为单胞肾形;后者菌落短绒毛状,分生孢子器柠檬黄,分生孢子为线型.通过油菜黑茎病菌L.biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物act F/act R,扩增产物片段约为720 bp,然后采用真菌通用引物ITS1/ITS4和引物act F/act R,针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增,经克隆测序结果比对分析发现,向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度.因此,依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR.在同一PCR管中3组引物(ITS1/ITS4,LLF/LLR和DHF/DHR)经优化体系后,ITS1/ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控,针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增.利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和255 bp的Actin基因的特异扩增带,向日葵茎溃疡病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和394 bp的Actin基因特异扩增带.所有菌株均未见非特异性片段的干扰.此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法.     

基于PCR和巢式PCR技术的玉米南方锈病早期检测

【目的】建立巢式PCR方法,快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌(Puccinia polysora),为玉米南方锈病(southern corn rust)的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列,在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R,建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系：Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL^-1)0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)2μL,d NTP Mixture(各2.5 mmol·L^-1)1.6μL,上下游引物(10μmol·L^-1)各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH₂O。扩增程序：利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,...     

应用巢式PCR检测葡萄根癌病菌

为建立葡萄根癌病菌的分子检测方法,应用细菌核糖体基因间隔片段(16S～23S ribosomal DNA intergenic spacer,ITS)通用扩增引物1405f/456r和葡萄根癌病菌ITS特异引物fI/rI,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对2株葡萄根癌病菌[即葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)]和10株非葡萄根癌病菌进行扩增,并且对接种葡萄根癌病菌的匍萄植株进行检测.结果表明,仅有葡萄根癌病菌能扩增出1条长度为607 bp的片段;巢式PCR检测方法可从接种15 d后的葡萄植株中特异性检测出病原菌,而病症的出现需要30～35 d的时间.说明该研究建立的巢式PCR方法可用于快速检测葡萄根癌病菌.     

利用巢式PCR检测花生青枯病菌

为建立花生青枯病菌的快速检测技术,本研究利用细菌16S-23SrDNA内源转录间隔区(ITS)通用引物L1/L2扩增花生青枯病菌基因组DNA并对其扩增序列进行克隆测序,通过与其同属近缘种做比较,设计1对特异性引物W1/W2,利用该对引物与细菌通用引物L1/L2建立了花生青枯病菌的巢式PCR检测方法。结果显示,引物W1/W2只能从花生青枯病菌中扩增出374bp的特异片段;巢式PCR检测灵敏度可达10fg·μL-1基因组DNA,较常规PCR提高1000倍;该技术可用于花生青枯感病期或者发病潜伏期时的病害检测。     

桉树焦枯病菌巢式聚合酶链反应快速检测方法的建立与应用

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BTA-1的设计和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的合成,分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较,同时本研究也对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。试验结果表明:利用beta-tubulin基因序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A对全部供试菌株进行扩增,所有参试菌株均可扩增出1条约500bp的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出1条148bp的明亮条带;当利用通用引物作为第1轮引物,以稀释10倍后的第1轮PCR产物作为第2轮PCR模板,利用特异性引物进行巢式PCR扩增时,也可扩增出上述148bp大小的明亮条带,且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明,巢式PCR的灵敏度可检测到5fg/μL,较常规PCR可以扩增出的极限(DNA质量浓度为5pg/μL)至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性,可达到田间检测的要求。本研究建立的巢式PCR检测技术可有效应用于桉树焦枯病的早期诊断。     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

应用种特异性ITS引物(SS-ITS)鉴别新菠萝灰粉蚧

[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考.     

葡萄炭疽菌和辣椒炭疽菌rDNA—ITS区序列比较

采用植物病原真菌核糖体基因ITS区通用引物对葡萄炭疽病和辣椒炭疽病的病原菌进行扩增,分别获得相应序列。序列比较结果表明,两者该区的序列同源性达91．27％,ITS1和ITS2区均存在差异,但ITS2区差异更丰富。