不同辣椒品种果实发育过程中DNA甲基化的MSAP分析

【目的】分析辣椒GB14和GB38果实发育过程中酶切位点的甲基化,为在分子水平上研究辣椒红素调控规律、在辣椒遗传育种中奠定理论基础。【方法】对辣椒果实发育成熟过程中的DNA甲基化修饰进行分析。【结果】DNA半甲基化条带比率与全甲基化条带比率均随着籽粒的生长发育而逐渐升高,两种辣椒果实绿熟期和红熟期基因组总体甲基化比例分别为36.51%、36.38%、35.57%和35.45%。对甲基化表现呈多态性变化的8个片段回收、测序分析表明,DNA甲基化发生的位点既存在于基因组的编码区,也存在于非编码区。【结论】在辣椒果实发育过程中,DNA甲基化修饰发生了巨大的变化;CCGG位点的半甲基化水平与辣椒红素积累呈正比。     

山核桃甲基化敏感扩增多态体系的建立与甲基化初步分析

山核桃Carya cathayensis为浙江省重要的经济树种。近年来细胞生物学及分子标记的研究发现,山核桃中存在无融合生殖,天然群体的多态性不佳,存在印迹数量性状位点（iQTLs）。iQTLs与DNA甲基化有关,而DNA甲基化对生物表观遗传调控起着重要的作用,是可遗传的生物现象。甲基化敏感扩增多态（MSAP）是基于PCR扩增多态性的DNA甲基化检测方法。在建立山核桃MSAP标记体系的基础上对来自3个天然居群的山核桃单株样品进行了分析。结果表明:山核桃存在甲基化,非甲基化相对水平大于总甲基化相对水平,且两者间差异极显著（Wilcoxon Rank Sum检验P < 0.001）,内侧胞嘧啶甲基化相对水平远大于半甲基化相对水平,且两者间差异极显著（分子方差分析及邓肯多重比较,P < 0.001）;天然居群山核桃内侧胞嘧啶甲基化相对水平高,则半甲基化相对水平和非甲基化相对水平则相对较低,反之亦然;居群间存在明显的表观遗传分化,主要变异存在于居群内。此外,山核桃的MSAP体系可用于薄壳山核桃Carya illinoensis,2个物种在位点及位点数上存在差异。     

桃同株叶片杂色材料的MSAP分析

为探寻桃同株叶片杂色材料PCM-1的突变机制,建立了桃PCM-1G和PCM-1R DNA样品的基因池,用256对甲基化敏感扩增多态性(MSAP)选择性扩增引物进行全基因组甲基化MSAP分析。筛选出23对条带清晰、丰富且重复性好的引物组合。扩增出200~1 000 bp的位点397个,其中PCM-1G、PCM-1R两种类型半甲基化位点分别为38个和44个,分别占全部位点的9.6%和11.1%;全甲基化位点分别为64个和67个,分别占全部位点的16.1%和16.9%;总甲基化率分别为25.7%和28.0%。成功分离了29条甲基化修饰DNA序列,通过测序发现有22条能够得到桃基因组支持且同源性较高,其中2条来自于类胡萝卜素裂解双加氧酶4(CCD4)、3条来自于Omega-羟基棕榈酸阿魏酸转移酶;推测CCD4和Omega-羟基棕榈酸阿魏酸转移酶可能与叶色嵌合突变有关。     

重金属铅镉对濒危植物中华水韭(Isoetes sinensis)DNA甲基化的影响

为研究古老植物对重金属胁迫的分子水平的响应,探究重金属对濒危植物DNA甲基化影响的特点,选择两种重金属Pb和Cd对濒危植物中华水韭进行胁迫处理,每种重金属设置3个处理浓度,胁迫处理至第28 d选取叶片,采用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)技术测定DNA甲基化程度。试验结果表明:重金属铅和镉均能够对中华水韭DNA甲基化产生影响,甲基化总体水平基本一致(对照、Pb处理和Cd处理分别为46.96%、48.23%和48.1%),但全甲基化水平(Pb处理是28.34%,Cd处理是20.25%)均低于对照(33.91%),而半甲基化水平(Pb处理是19.89%,Cd处理是27.85%)均高于对照(13.04%)。甲基化增强的变化,以无甲基化或内外侧胞嘧啶半甲基化向内外侧胞嘧啶全甲基化变化的模式为主。去甲基化的变化,以内外侧胞嘧啶全甲基化向无甲基化或内侧胞嘧啶半甲基化或全甲基化变化的模式为主。铅和镉胁迫在导致中华水韭DNA甲基化增强所占比率方面几乎相等(39.04%和39.71%),而在去甲基化所占比率方面镉(46.86%)高于铅(33.92%)。     

20株香菇菌株的ISSR和F-MSAP分析

利用简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat,ISSR)和荧光标记甲基化敏感扩增多态性(fluorescence-labeled methylation-sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)分子标记技术对收集到的20株香菇Lentinula edodes菌株进行遗传及甲基化多样性分析。ISSR结果表明,8对引物共可扩增出98条稳定清晰可辨的条带,其中多态性条带89条,多态性比率为90.82%,样品间的遗传相似系数范围为0.520 4~0.9897。F-MSAP结果表明,15对引物共扩增产生13 487个CCGG位点。在全部检测位点中,半甲基化位点为1 704个,平均半甲基化率12.6%;全甲基化位点为1 865个,平均全甲基化率13.8%。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性(methylation sensitive polymorphism,MSP)和甲基化不敏感多态性(methylation insensitive polymorphism,MISP)。Mantel检测结果表明,ISSR与MISP分子标记的分析结果有显著的相关性,但ISSR与MSP分子标记的分析结果无显著相关性。说明香菇不同株系间广泛存在DNA甲基化多样性,在育种中具有重要的应用价值。     

家鸡胚胎发育过程DNA甲基化的MSAP检测

[目的]检测鸡胚不同发育阶段时的DNA甲基化水平。[方法]以不同发育阶段的家鸡胚胎为试验材料,提取基因组DNA,采用甲基敏感扩增片段多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术对其甲基化水平进行了初步检测。[结果]共发现甲基化位点880个,CCGG位点单链外侧的胞嘧啶甲基化位点比例为20．48％,双链CCGG位点的内侧胞嘧啶甲基化19．30％,两者总比例为39．78％。[结论]鸡胚发育过程,DNA甲基化随着胚胎的发育呈升高趋势。     

5-氨基乙酰丙酸对氯化钠胁迫下玉米基因组DNA甲基化模式及水平的影响

以玉米自交系B73为材料,用不同质量浓度的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)浸种处理,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,分析NaCl胁迫下的DNA甲基化模式及水平.结果 表明:各试验组的甲基化敏感扩增多态性分别为70.94％、68.96％、71.77％.各试验组的甲基化敏感扩增单态性分别为29.06％、31.04％、28.23％.当5-ALA质量浓度为0.05 mg/L时,总甲基化率下降2.87％,半甲基化率下降20.29％,全甲基化率下降18.72％;当5-ALA质量浓度为0.10 mg/L时,总甲基化率下降5.13％,半甲基化率下降19.15％,全甲基化率下降20.32％;当5-ALA质量浓度为0.50 mg/L时,总甲基化率下降4.82％,半甲基化率下降20.96％,全甲基化率下降20.72％.这种甲基化现象使玉米自身的抗盐能力提高.     

干旱胁迫下复苏植物牛耳草基因组DNA甲基化分析

利用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,研究干旱复苏过程中,牛耳草叶片DNA甲基化水平及动态变化情况.5对引物对共扩增出376个CCGG位点,其中188个位点发生了甲基化或去甲基化变化.处理组总甲基化水平均高于对照组,且均以Ⅰ型CHG(半甲基化)位点为主,占约32.3%~40.2%.牛耳草干旱复苏过程DNA甲基化和去甲基化同时发生,但以去甲基化为主.此外,qRT-PCR技术检测Bh Dnmt2、Bh CMT2等DNA甲基化相关酶基因在干旱复苏过程中的表达,发现均有明显变化.综上,DNA甲基化参与了牛耳草的抗旱复苏过程,可能是通过甲基化/去甲基化调节基因表达,从而参与牛耳草的抗旱分子反应.     

大麦不同组织成熟过程中DNA甲基化的MSAP分析

DNA甲基化参与调控生长植物发育。使用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)方法并结合毛细管自动电泳分析仪,对大麦(Hordeum vulgare L)的种子、根、茎、叶等4种组织在成熟过程中的DNA甲基化修饰进行了分析。结果表明,大麦不同组织在成熟过程中基因组总甲基化水平改变较小,但44.90%~65.17%的CCGG位点甲基化模式在不同组织在成熟过程中发生了改变。在大麦种子成熟过程中,CCGG位点半甲基化水平急剧升高,达到65.40%,全甲基化位点显著下降仅为13.39%,与其他组织的甲基化特征差异显著。结果显示,在大麦组织成熟的过程中,DNA甲基化修饰发生了巨大的变化。     

镉处理下平邑甜茶DNA的甲基化分析

采用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,对镉处理的平邑甜茶叶片DNA进行甲基化位点分析,研究镉对其甲基化多态性的影响。结果表明:在0(CK)、2.5 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1镉处理下,9对MSAP引物扩增,甲基化出现三种不同模式即未甲基化A、半甲基化B和全甲基化C,共扩增出3150条谱带,单对引物最多扩增656条,最少为610条。5 mg.L-1镉处理的平邑甜茶甲基化较高,比例达到60.1%;10 mg.L-1镉处理的平邑甜茶甲基化较低,比例达到57.6%;与对照相比,镉处理的平邑甜茶甲基化水平降低,可能镉抑制了其基因的表达。     

碳源对山核桃体细胞胚发生和植株再生的影响

以山核桃Carya cathayensis花后10～12周的幼胚为外植体,建立体胚发生及再生体系,同时分别对山核桃胚性愈合组织和体细胞胚诱导的碳源种类和质量浓度进行了比较分析。结果表明：接种在含葡萄糖培养基中的山核桃胚性愈合组织诱导率显著高于蔗糖、海藻糖和麦芽糖,诱导率达33.3%;在培养基中添加20 g.L-1葡萄糖,胚性愈合组织诱导率最高,达50.0%,显著高于其他处理。蔗糖为山核桃体细胞胚诱导的最佳碳源种类,体细胞胚诱导率显著高于葡萄糖、海藻糖和麦芽糖,诱导率达23.3%;在培养基中添加45 g.L-1蔗糖,体细胞胚诱导率最高,达30.1%,显著高于其他处理。体胚在WPM培养基（木本植物用培养基）附加5 g.L-1蔗糖的培养基上萌发率达20%,显著高于附加0,10,15,20,25,30 g.L-1蔗糖的体胚萌发率。     

山核桃幼胚不定芽的诱导

以山核桃Carya cathayensis花后60,75和100d的幼胚为外植体,金属硫蛋白（MT）复合维生素＋20g·L^-1葡萄糖＋10mg·L^-1腺嘌呤＋500mg·L^-1水解酪蛋白作为基本培养条件,研究山核桃幼胚的不同发育时期,不同植物生长调节物质及基本培养基对山核桃不定芽诱导的影响。结果表明,山核桃花后60d的幼胚培养56d后未形成不定芽,花后100d的幼胚比花后75d的幼胚诱导产生的不定芽多而且长;植物生长调节物质对山核桃不定芽诱导以0.0100mg·L^-14-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧-酸（Picloram）＋3.0mg·L^-16-苄氨基腺嘌呤（6-BA）为启动培养基较佳;当6-BA质量浓度一定时,随Picloram质量浓度增加不定芽数量差异不显著;当Picloram质量浓度一定时,随6-BA质量浓度增加,产生不定芽数逐渐上升,但当6-BA达10mg·L^-1时,不定芽出现明显玻璃化现象;2,4-D的添加不利于外植体不定芽产生;MS（Murashige and Skoog）是最佳基本培养基。     

山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究

采用甲醇溶剂对山核桃Carya cathayensis外果皮进行提取,并用提取物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea,番茄早疫病菌Alternaria solani,黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.cucumerinum,黄瓜炭疽病菌Colletotrichum lagenarium,棉花枯萎病菌Fusarium oxysporumf.vasinfectum等15种病菌进行抑菌试验。结果表明：在供试质量浓度为干样100 g.L-1时,山核桃外果皮甲醇提取物对黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌、苹果腐烂病菌和辣椒疫病菌等4种病菌的抑制率为100%,除玉米小斑病菌Bipolaris maydis外,对其余的10种病菌抑制率都在69%以上。对其中6种供试病菌菌丝生长的毒力测定试验表明：山核桃外果皮甲醇提取物对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solan的菌丝生长抑制作用最好（半数效应质量浓度为29.8 g.L-1）,其次为番茄灰霉病菌（半数效应质量浓度为31.1 g.L-1）,对玉米大斑病菌Exserohilumturcicum作用最差（半数效应质量浓度为46.2 g.L-1）。利用山核桃外果皮开发植物源杀菌剂值得进一步研究。     

山核桃SSR标记的初步开发

基于山核桃Carya cathayensis脂肪代谢相关cDNA文库的部分测序结果,发现43条cDNA序列具有简单重复序列(SSR)碱基重复特点,用Primer Premier 5设计了34对表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)引物;建立了适用于山核桃的SSR分析体系,并用设计的SSR引物对对天然群体山核桃40个样品进行了初步的应用性试验.结果表明:34对引物中有4对无扩增产物,3对引物的扩增产物超过了设计范围,27对引物在供试的40个山核桃材料中有较清晰且稳定的目标扩增产物,其中有18对引物的扩增产生了22个多态性位点,占总扩增位点数的47.8％.将SSR标记分析结果与山核桃已有的显性标记分析结果进行比较,发现SSR标记多态性位点的比例较高,且能够区分显性纯合位点及显性杂合位点.结论:设计开发山核桃的EST-SSR标记是可行有效的.     

山核桃幼胚不定芽的诱导

以山核桃Carya cathayensis花后60,75和100 d的幼胚为外植体,金属硫蛋白（MT）复合维生素+ 20 g·L-1葡萄糖+10 mg·L-1腺嘌呤+500 mg·L-1水解酪蛋白作为基本培养条件,研究山核桃幼胚的不同发育时期,不同植物生长调节物质及基本培养基对山核桃不定芽诱导的影响。结果表明,山核桃花后60 d的幼胚培养56 d后未形成不定芽,花后100 d的幼胚比花后75 d的幼胚诱导产生的不定芽多而且长;植物生长调节物质对山核桃不定芽诱导以0.010 0 mg·L-1 4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧-酸（Picloram） + 3.0 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤（6-BA）为启动培养基较佳;当6-BA质量浓度一定时,随Picloram质量浓度增加不定芽数量差异不显著;当Picloram质量浓度一定时,随6-BA质量浓度增加,产生不定芽数逐渐上升,但当6-BA达10 mg·L-1时,不定芽出现明显玻璃化现象;2,4-D的添加不利于外植体不定芽产生;MS（Murashige and Skoog）是最佳基本培养基。图1表2参16     

模拟不同类型酸雨胁迫对山核桃生理特征的影响

随着经济的发展,中国酸雨污染类型由硫酸型向硫酸、硝酸复合型转变,为了解转变对我国陆地植物生态系统的影响,以山核桃（Carya cathayensis）为试验对象,研究模拟硫酸型酸雨（SAR）、硝酸型酸雨（NAR）及混合型酸雨（MAR）对山核桃的生理特征影响。试验测定了山核桃在不同酸雨类型下,生长量,叶绿素含量和光合反应参数在pH值为5.6,4.0,2.5时的数据。结果表明：SAR处理下,山核桃的株高、基径在pH 5.6时高于另两个梯度,NAR处理下,生长量的大小为pH 5.6处理MAR>SAR,有显著差异,但三种酸雨类型各梯度间的叶绿素含量差异不显著;三种酸雨对山核桃的光合作用都产生抑制,净光合速率在pH 2.5处理下小于pH 56处理,对表观量子效率（AQE）、最大净光合速率（Pnmax）、光饱和点（LSP）都表现为MAR相似文献   

尿素包合法分离纯化山核桃油中亚油酸的研究

为优化尿素包合纯化山核桃油中亚油酸的工艺,采用单因素和正交试验,研究了尿素包合反应中温度、时间、脂肪酸/尿素、甲醇/尿素等因素对亚油酸纯度及得率的影响。结果表明：在m（脂肪酸）/m（尿素）为0.3,V（甲醇）/m（尿素）为2.5,包合温度为-5℃,包合时间为24 h的优化条件下,山核桃油中亚油酸的含量由23.80%提高到80.73%。     

山核桃嫁接愈合过程的解剖学观察

山核桃嫁接经过了愈伤组织形成、对接、维管束桥的形成及维管分化等过程。休眠的形成层薄，只有3层左右细胞，嫁接后9d，愈伤组织首先发生于形成层，再在皮层和韧皮部处发生；14d后，愈伤组织对接，呈点状分布，隔离层也逐渐消失；接后24d，维管束桥形成，并进一步分裂分化产生输导组织，实现嫁接体的完全愈合。山核桃形成层薄，嫁接时很难与砧木准确对接，这是山核桃嫁接成活率低的原因，以化香为砧木嫁接山核桃则存在不亲合现象。图1参10。     

山核桃开花生物学特性与雌花可授期

采用去雄套袋控制授粉技术对山核桃花器官构造、发育规律以及雌花可授期进行研究．结果表明：山核桃花器官具有明显的风媒传粉适应机制;雄花散粉期短,集中散粉期仅3d,并呈现爆发性,雌花在显花期柱头颜色先后经历青绿色-微红色-鲜红色-紫红色-紫黑色的变化过程,发育进程不一;雌花适宜授粉时期为柱头呈鲜红色时,其坐果率达47．77％,雌花有等待授粉的习性,约有10d的等待授粉期．     

基于GIS的杭州市山核桃种植生态适宜性评价

根据山核桃生产的实际情况,采用 GIS 技术、模糊数学方法和层次分析法,对杭州市山核桃种植进行生态适宜性评价。首先采用特尔菲法从气候、地形、土壤条件3个方面选取生态因子,建立杭州市山核桃生态适宜性评价指标体系,再根据各生态因子对山核桃生长与品质的影响建立隶属函数,并运用层次分析法计算各指标权重。评价结果表明：杭州市山核桃最适宜栽培面积占评价区域的30.54%,适宜栽培面积占46.52%,不适宜栽培面积占22.94%。该研究运用空间模糊综合评价方法所得出的评价结果与目前杭州市山核桃种植区的分布大体一致,较之传统的评价方法,该方法具有评价周期短、评价结果更加精确、更有利于小区域范围内生态适宜性评价等优点。