抗嗜水气单胞菌IgY的提纯及体外抑菌效果研究

以灭活嗜水气单胞菌(AS 1.927菌株)为抗原免疫蛋鸡,采用水稀释法粗提蛋黄液IgY和硫酸铵法纯化粗提物中IgY,研究其在上清液中的抗体提取率及其体外抑菌效果.研究表明,pH 5.0、10×水稀释法粗提后上清液中IgY抗体提取率为78.34%,33%(v/v)饱和硫酸铵法纯化后上清液中抗体提取率为64.1%,SDS-PAGE电泳显示纯化后的IgY纯度较高.pH 5.0、10×水稀释法粗提后的特异性IgY浓度达1.0 mg/mL时,嗜水气单胞菌在18 h内无生长.结果提示,用水稀释法和硫酸铵法提取蛋黄中的抗嗜水气单胞菌特异性IgY,具有简便、快捷、高效的特点,所制备的IgY活性较高,可用于嗜水气单胞菌感染引起的水生动物疾病预防和控制.     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果

 为了检验大肠杆菌表达的兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白（VP60）对兔的免疫保护效果，将34只清洁兔随机分成3组：单用免疫佐剂对照组（8只）、单用重组VP60组（8只）和重组VP60加免疫佐剂组（18只），分别经皮下注射，VP60的免疫剂量为每只每次400 μg，免疫2次，间隔7 d。在第2次免疫7 d后，VP60加免疫佐剂组的兔血清抗体水平显著高于单用VP60免疫组（ELISA 1∶64 000 对比1∶4 000 / HI 1∶128 对比1∶16），表明免疫佐剂可明显加速重组VP60诱导抗体产生的进程，用RHDV NJ85强毒攻击，免疫佐剂对照组与单用VP60免疫组的实验兔均全部死亡（8/8和8/8），VP60加免疫佐剂组均全部存活，保护率为100%（18/18）。用RHDV血凝试验（HA）检测，死亡兔的肝脏组织液HA效价大于1∶512，而存活兔的肝脏组织液HA效价小于1∶2，肝脏组织触（涂）片检查和细菌培养均为阴性，证明病死兔系RHDV感染所致。用RHD重组亚单位疫苗在养兔场进行800只兔的田间免疫试验，安全有效，没有出现不良反应。对重组菌进行冻存、复苏、培养、诱导表达和质粒酶切分析，证明VP60基因在宿主菌内保持稳定。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，通过比较免疫后血凝抑制(HI)抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标评价其免疫保护作用。免疫后21d，重组鸡痘病毒免疫组仅有13％～20％鸡的HI抗体检测呈阳性。在同亚型禽流感病毒攻击后，重组鸡痘病毒疫苗免疫组产生了100％的保护率，而未免疫组全部死亡。结果表明：重组鸡痘病毒疫苗不能激发高滴度HI抗体应答，但可抵御同亚型禽流感病毒致死性攻击，保护效果达到或优于目前应用的灭活苗，显示出良好的应用前景。     

减毒沙门氏菌介导H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用研究

构建获得含有H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组真核表达质粒pCAGGS-HA。重组质粒电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,获得重组沙门氏菌SL7207(pCAGGS-HA)。重组菌SL7207(pCAGGS-HA)以5×109cfu的剂量2次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡后,再以油乳剂灭活疫苗加强免疫1次,并设立重组菌单独免疫组、灭活苗免疫组、空载体免疫组及空白对照组。联合免疫组和重组菌单独免疫组的小肠黏膜抗体效价与其他组之间存在显著差异(P<0.05),且两组的攻毒免疫保护水平与空载体组之间差异显著(P<0.05),其中联合免疫组的免疫保护率最高,达100%,而灭活苗免疫组保护率为80%,表明减毒沙门氏菌介导的H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用具有良好的免疫协同作用。     

团头鲂细菌性败血症免疫研究

将温和气单胞菌(Aeromonas sobria)复壮,在28℃条件下加福尔马林灭活48 h,制备成灭活苗.用该疫苗免疫团头鲂,取免疫后第10 d,20 d,30 d的血清做凝集抗体试验,最高凝集抗体效价达1∶32～128,对照组为1∶4～8;免疫鱼的抗感染保护力达70%.     

鸡传染性支气管炎二价灭活苗的研制

从上海、江苏、大连等地的患病鸡群中分离到８株病毒，经鉴定确认为鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）。从中挑选出２株具代表性毒株（Ｃ９００１、ＤＬＺ９１１１）研制出二价油佐剂灭活苗。结果表明，１∶１００稀释的二价油佐剂灭活苗最小免疫剂量０．５ｍｌ／只，一次免疫对支气管炎型ＩＢ的保护率可达６６．６７％，对肾型ＩＢ的保护率可达８３．３３％。０．２ｍｌ的二价苗免疫１５日龄的雏鸡，１５ｄ后攻毒，对肾型ＩＢ的保护率达１００％，而肾型和支气管炎型单价苗的免疫保护率分别为９０％和８０％。通过实验室的免疫试验和临床应用，证明安全高效。     

禽流感病毒疫苗免疫效果的分析

通过检测免疫禽流感病毒后禽类所产生抗体滴度,并进行比较和分析,结果发现,蛋鸡在85日龄左右进行禽流感疫苗免疫效果最佳(P0.01),H5亚型禽流感免疫鸡和鸽其抗体滴度达到了5以上,而对鹌鹑和鸭几乎没有效果;单价禽流感疫苗和多价苗对鸡群免疫的效果不同,多价苗的免疫效果不如单价苗。     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

猪产肠毒素大肠杆菌987P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌（ETEC）987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体（IgY）的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24 h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍（214）,但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

氨氮质量浓度对感染白斑综合症病毒的凡纳滨对虾的影响

研究了氨氮质量浓度渐变和突变对白斑综合症病毒(WSSV)在凡纳滨对虾体内增殖的影响。结果表明:在氨氮质量浓度突变组实验中,氨氮质量浓度从起始浓度0.05 mg·L-1向中浓度1.25 mg·L-1和高浓度3.0 mg·L-1突变过程中对凡纳滨对虾的累积死亡率和对虾体内病毒增殖影响显著(P0.05),先氨氮突变后感染WSSV实验中氨氮起始、中、高浓度胁迫下对虾累积死亡率分别为25.6%,34.4%和48.9%;病毒含量最大值分别为9.59×105,5.75×106,1.62×106copy·g-1。先感染WSSV后氨氮突变实验中氨氮起始、中、高浓度胁迫下对虾累积死亡率最大值分别为30%,38.9%和48.9%;病毒含量最大值分别为9.59×105,9.58×105,4.94×106copy·g-1,氨氮浓度渐变实验中各组至24 h对虾累积死亡率较低(P0.05),48 h后开始出现显著差异(P0.05)。先氨氮渐变后感染WSSV实验中氨氮起始、中、高浓度胁迫下对虾累积死亡率最大值分别为28.9%,30.0%和45.6%,病毒含量最大值分别为9.59×105,4.48×106,1.86×106copy·g-1。先感染WSSV后氨氮渐变实验中氨氮起始、中、高浓度胁迫下对虾累积死亡率分别为25.6%,33.3%和45.6%;病毒含量最大值分别为9.59×105,8.58×105,6.55×106copy·g-1。这表明对于携带WSSV的对虾,氨氮变化越大,WSSV从潜伏感染转为急性感染的可能越大,所以控制水质中氨氮含量在低浓度水平对预防WSS爆发至关重要。     

白斑综合征病毒（WSSV）感染淡水枝角类的初步研究

采用WSSV发病对虾组织碎块投喂、WSSV粗提液投浸、WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌和酵母菌投喂对淡水枝角类进行白斑综合征病毒（WSSV）攻毒,然后将攻毒前后的淡水枝角类进行PCR检测。结果表明,投喂WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌可以感染淡水枝角类。     

两个对虾新型表达载体的构建

【目的】构建一种能在对虾细胞内稳定存在的新型表达载体,为对虾口服疫苗的研制奠定基础。【方法】设计特异性引物,以对虾白斑综合症病毒（WSSV）DNA为模板,PCR扩增早期基因启动子IE1的不同长度片段IE（-94/＋52）和IE（-945/＋52）;利用限制性酶切及连接的方法,以IE（-94/＋52）和IE（-945/＋52）替换pcDNA3.1-GFP的CMV启动子;然后将构建好的表达载体与阳离子脂质体转染试剂TransLipidTM混合,肌肉注射凡纳滨对虾。【结果】经双酶切鉴定,表达载体pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP分别获得6150和146 bp、6150和997 bp的目的条带;注射pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP的对虾部分体细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,且注射pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP的绿色荧光强度强于注射pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP。【结论】构建的两个新型表达载体pcDNA3.1-IE（-94/＋52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/＋52）-GFP均可用于对虾病毒抗原蛋白基因的表达。     

抗猪瘟IgY的制备及临床应用初报

应用合理的免疫程序,用猪瘟抗原免疫蛋鸡,并以水稀释法、聚乙二醇萃取法结合透析对所产蛋的卵黄部分进行处理,成功地提取到抗猪瘟IgY(SF-IgY),获得率为6.83mg/mL。该制剂纯度为45.14％,能中和1000MID猪瘟兔化种毒,用于紧急治疗猪瘟后,临床应用效果确实。     

Prophylactic and therapeutic effects of egg yolk immunoglobulin against porcine transmissible gastroenteritis virus in piglets

Porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) is the causative agent of acute diarrhea of newborn piglets that provokes high mortality rates in affected farms. In this study, specific immunoglobulin from egg yolk against TGEV was produced by immunization of White leghorn hens. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and virus neutralization (VN) test revealed that the specific antibody titer started to increase on the tenth day post-immunization, reached its peak on the eighth week, and remained at a high level until the last week that we tested. The prophylactic and therapeutic effects of egg yolk immunoglobulin (IgY) was investigated in piglets. IgY was found effective to increase piglets survival rate significantly after challenge exposures in prophylactic efficacy analysis. The therapeutic effects test revealed that the mortality was dramatically reduced by orally administered IgY. All these results in our study indicated that IgY specific to TGEV could be an alternative prophylactic method like colostral antibodies against TGEV in piglets.     

罗氏沼虾健康育苗技术研究

【目的】掌握罗氏沼虾健康育苗的关键技术,为罗氏沼虾育苗生产提供科学参考。【方法】2010年6月,在127.3m3水体中投放2700.00万尾罗氏沼虾幼体进行健康育苗试验,综合育苗幼体PCR病毒检测、控制适中育苗密度、加强水质调控、禁止使用抗生素等主要技术措施,培育23～27d。【结果】90%幼体变态,获得淡化虾苗1721.30万尾,单位水体产量13.50万尾/m3,平均育苗成活率为63.69%,平均运输成活率为86.0%。经检测,虾苗种质量达到罗氏沼虾苗种标准（DB45/T515-2008）的要求。【结论】采用健康育苗技术可有效提高罗氏沼虾苗质量及养殖成活率,其健康育苗技术主要包括：保持育苗水质良好、控制中等的育苗密度（15.00万尾/m2）、禁止使用抗生素、不滥用药物及防治育苗病害等措施。     

犬ELF4基因原核表达及其卵黄抗体的制备

【目的】克隆犬转录因子ELF4基因（cELF4）,体外表达重组cELF4蛋白（rcELF4）并制备抗该蛋白的卵黄抗体（IgY）,为深入探究犬ELF4蛋白功能提供基础材料。【方法】采用RT-PCR扩增cELF4基因,将目的基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒并测序,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码的氨基酸序列特征。将cELF4基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET28a-cELF4,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。将rcELF4蛋白分别与3种免疫佐剂（ISA 15AVG、 ISA 71VG、 ISA 201VG）乳化制备免疫原,通过免疫蛋鸡检测抗体滴度和IgY含量。构建真核重组表达载体pEGFP-cELF4,转染细胞后,利用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）分析cELF4特异性IgY的免疫活性。【结果】cELF4基因（GenBank登录号MZ198105）的开放阅读框（ORF）为1992 bp,编码663个氨基酸残基。cELF4基因与狐ELF4基因的核苷酸相似性最高 （99.3%）,而与小鼠的相似性最低 （81.5%）。结合系统进化结果发现, cELF4基因与狐、大熊猫、欧洲雪貂、北美水獭等动物ELF4基因的亲缘关系较近,而与人和猴等灵长类动物及啮齿类鼠ELF4基因的亲缘关系相对较远。rcELF4蛋白分子量大小约100 kD,可刺激鸡产生相应抗体, ISA 15AVG、 ISA 71VG和ISA201VG组血清抗体滴度均在首免后38 d达峰值,其中ISA 201VG组效价最高 （>128000倍）,且3组rcELF4特异性IgY抗体均在首免后14 d转阳,首免后35 d达峰值,其中ISA 201VG组血清抗体滴度最高,为256000倍。3组鸡蛋卵黄中所提取的IgY含量最高值为4.09 mg/10 mL卵黄液,与rcELF4蛋白呈特异性反应、且与人ELF4蛋白存在交叉反应。rcELF4蛋白定位在细胞核。【结论】 rcELF4蛋白在大肠杆菌中成功表达,且存在翻译后修饰现象,不同类型的免疫佐剂对rcELF4蛋白的免疫原性产生不同的影响,所制备rcELF4抗体免疫活性良好,且与人ELF4蛋白存在交叉反应。     

5种饵料对日本囊对虾早期生长及感染WSSV存活率的影响

采用人工配合饲料、鱼粉、丰年虫无节幼体、虾片和牡蛎肉5种不同饵料投喂日本囊对虾幼虾,实验周期20d,测量日本囊对虾的体长、体重及计算其成活率。结果表明,5种饵料对日本囊对虾生长的影响差异显著（P〈0.05）,其中丰年虫组体长、体重的增长明显优于其他各组,差异达极显著水平（P〈0.01）,牡蛎肉组次之,配合饲料组的体长、体重增长最小,鱼粉组体长、体重增长大于虾片组。人工投喂WSSV感染5种不同饵料投喂的日本囊对虾幼虾,实验周期10d。丰年虫组和鱼粉组的存活率最高,明显高于配合饲料和牡蛎肉两实验组,差异达极显著水平（P〈0.01）;丰年虫组和鱼粉组之间存活率无显著差异（P〉0.05）,人工配合饵料组和牡蛎肉组差异不显著（P〉0.05）。半定量PCR检测表明,感染前日本囊对虾幼虾均不携带WSSV,感染后全部个体均检测到相应的病毒特征片段。     

新城疫和传染性法氏囊病二联疫苗的免疫效力研究

以LaSota系新城疫(ND)病毒制成ND弱毒疫苗,以含传染性法氏囊病(IBD)病毒VP2基因重组质粒pET28a/VP2的大肠杆菌BL21制成IBD重组活载体疫苗,将ND弱毒疫苗和IBD重组活载体疫苗组建ND-IBD二联疫苗.将试验鸡分成8个组,分别肌肉注射接种ND弱毒疫苗、IBD重组活栽体疫苗和ND-IBD二联疫苗.最后一次接种后第10天,对所有试验鸡进行采血,分离血清,以病毒血凝抑制试验(HI)及琼脂免疫扩散试验检测NDV抗体和IBDV抗体.对NDV HI抗体阳性率进行x2检验及对NDV HI效价进行方差分析,结果对照组与其他4组之间差异均显著(P＜0.05),而试验组(B、C、D、E)4组之间差异均不显著(P＞0.05).对IBDV抗体阳性率进行x2检验及对IBDV沉淀抗体滴度进行方差分析,结果在A、B、F 3组之间差异不显著(P＞0.05),在C、D、G、H 4组之间差异不显著(P＞0.05);而A、B、F 3组与C、D、G、H 4组之间差异显著(P＜0.05).试验表明,在诱导雏鸡体液免疫应答方面,ND-IBD二联疫苗与ND弱毒疫苗和IBD重组活载体疫苗具有同样的效力.     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。