棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时（一对真叶期）,分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis,DPA）纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

鸭梨PAL克隆及其在果实发育和机械伤害过程中的表达

【目的】克隆鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）序列,并分析其在果实发育阶段和机械伤害时的表达模式,为研究鸭梨褐变机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法,获得鸭梨PAL全长序列;利用在线生物信息学软件对其进行分析;采用MEGA 5.1软件构建PAL蛋白系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术分析PAL在鸭梨果实发育阶段及受机械伤害过程中的表达。【结果】在鸭梨中获得了2个含完整CDS区的PAL,分别命名为PbPAL1和PbPAL2。PbPAL1 cDNA序列全长为2 232 bp,含2 160 bp完整开放阅读框、60 bp的5′非翻译区及12 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906268.1;PbPAL2 cDNA序列全长为2 387 bp,含2 163 bp完整开放阅读框、14 bp的5′非翻译区及210 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906269.1。系统进化分析表明PbPAL1和PbPAL2位于分子进化树的不同分支,PbPAL1与西洋梨（Pyrus communis）的PAL同源性较高,而PbPAL2与桃（Prunus persica）的PAL同源性较高。定量PCR分析表明,随着鸭梨果实发育成熟,果皮、果肉和果心的PbPAL1和PbPAL2表达量各异,但均呈下降趋势;且果实发育早期果心中的PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉。损伤处理可迅速诱导鸭梨的果肉褐变,果皮褐变出现较晚;同时,损伤刺激果皮和果肉组织中PbPAL1和PbPAL2表达上调。果皮中PbPAL1表达量在损伤处理后6 h达到高峰,而PbPAL2在损伤处理后48 h才显著上升;果肉中PbPAL1在损伤处理后1 h表达量开始显著上升,而PbPAL2在损伤处理后12 h才显著上升。【结论】鸭梨PbPAL1和PbPAL2属于2个不同的PAL类型,其表达随果实发育呈下降趋势,机械损伤过程中,两基因表达显著上调,表明其参与了损伤引起的组织褐变过程。     

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase,Tre-1）全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守序列,预测开放阅读框（ORF）序列,分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF,最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术,采用2^-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3 129 bp,命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078）,其中包含5'端441 bp非编码区和3'端945 bp非编码区,ORF为1 743 bp,共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD,等电点为5.95;有1个信号肽结构（1-21位）,1个甘氨酸富集区（GGGGEY）,2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP）,6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列,无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性很高,分别为99%和98%,与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的Tre-1一致性也达到78%;系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近,与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达,在中肠的表达量最高,其次是马氏管,其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹,工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律,在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列,其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似,该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高,此外,幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂,工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势,为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。     

绿盲蝽TRPA1基因的鉴定及功能分析

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）TRPA1基因,明确其在成虫不同组织中的表达分布,研究绿盲蝽TRPA1基因的功能,阐明绿盲蝽感受温度的分子基础。【方法】在绿盲蝽转录组测序的基础上,通过生物信息学方法分析转录组数据,得到编码绿盲蝽TRPA1基因的cDNA序列片段。根据已知的cDNA序列,设计引物。采用RT-PCR及RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆TRPA1基因的全长序列,并通过DNAMAN软件及BLAST分析测序结果。测序正确后,使用在线工具SMART及TMpred预测TRPA1蛋白的锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats）及跨膜结构域序列。通过序列比对,构建昆虫TRP（transient receptor potential）通道的家族进化树,分析绿盲蝽TRPA1与其他物种同源基因的相似性及进化地位。以GADPH为内参基因,利用RT-PCR检测绿盲蝽TRPA1在成虫触角、头、喙、足、腹等不同组织中的相对表达量。通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录技术研究绿盲蝽TRPA1对温度刺激的反应。【结果】通过绿盲蝽转录组数据预测得到TRPA1基因的4个cDNA序列片段,经过RT-PCR及RACE技术克隆得到了绿盲蝽TRPA1的全长序列,并命名为AlucTRPA1。AlucTRPA1开放阅读框全长3 672 bp,编码1 223个氨基酸。通过在线工具SMART及TMpred预测分析结果表明,AlucTRPA1含有16个锚蛋白重复序列结构及6个保守的跨膜结构域。序列比对及进化树分析结果显示,昆虫TRPA家族包含TRPA1、Painless、Pyrexia及Water witch,AlucTRPA1属于昆虫TRPA1亚家族。AlucTRPA1与其他昆虫的同源基因具有很高的相似性,特别是与同属半翅目的豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）的同源性高达65.1%。成虫组织表达谱分析结果表明,AlucTRPA1在成虫触角中的表达量最高,头、喙、足、腹中也都有表达。爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录结果表明20℃至40℃逐渐上升的温度可以直接激活AlucTRPA1通道,且两次连续重复的温度刺激未引起AlucTRPA1通道的钝化。【结论】AlucTRPA1在绿盲蝽成虫的触角、头等组织中均有表达,且在爪蟾卵母细胞表达的AlucTRPA1能被20℃至40℃逐渐上升的温度刺激直接激活,推测AlucTRPA1在绿盲蝽体内是直接的温度感受器,参与调控绿盲蝽对生活环境温度的感知行为。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析

 【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。     

病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响

以棉花为研究对象,利用转录后基因沉默技术(VIGS)将棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)基因沉默,研究沉默后植物的氨基酸、多胺、一氧化氮(NO)等含氮化合物的代谢变化。结果表明:盐胁迫可以诱导棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)瞬时上调表达,GhASS1沉默严重影响氨基酸的合成,除天门冬氨酰(Ans)外,其他蛋白质组成型氨基酸质量分数显著降低,NO质量摩尔浓度和多胺(PAs)质量分数下降,棉花植株生长发育迟缓。GhASS1沉默对棉花精氨酸脱羧酶基因(GhADC)、棉花鸟氨酸脱羧酶基因(GhODC)表现出强烈的抑制作用,进而影响植物多胺的代谢和耐盐能力。高浓度盐环境下,沉默体系精氨酸(Arg)和NO质量摩尔浓度上升,GhARG1表达上调。GhASS1沉默对于植物是致命的,GhASS1是尿素循环和氨基酸代谢的关键环节,GhASS1沉默使GhARG1、GhADC和GhODC表达下调,严重影响整个氨基酸代谢,NO质量摩尔浓度,腐胺(Put)和精胺(Spm)质量分数显著降低,N代谢受阻,植株发育不良,生长迟滞,棉花中存在Arg-NO通路。     

组合生防菌与解盐促生菌复配对棉花的促生效应

【目的】研究多功能菌剂BCL-Rs对盐胁迫和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)危害下棉花生长的影响。【方法】组合生防菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BCL-8与解盐促生菌产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)Rs-5复配获得BCL-Rs,通过盆栽、小区和大田试验对BCL-Rs促进棉花生长的功能进行验证。【结果】BCL-Rs对立枯丝核菌有很好的抑菌活性,并且能够有效提高棉花的耐盐性。盆栽试验和小区试验结果表明,BCL-Rs对棉花立枯病的防治效果分别达到了55.37%和51.06%,在盐胁迫条件下使棉苗干重分别提高了40.85%和25.81%,具有显著的防病促生和缓解盐胁迫的效能。棉花大田试验结果表明,BCL-Rs包衣处理及滴灌处理对棉花苗期生长有明显的促进作用,可显著提高棉花植株的鲜重、干重和株高,增大植株的叶面积,较常规处理增产10.51％。【结论】在BCL-8的防病性能与Rs-5的解盐促生功能的协同效应下,BCL-Rs能够更有效地防治盐胁迫条件下的棉花立枯丝核菌造成的危害。     

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

不同DPC(缩节胺)处理对棉花生理生化特性的影响

[目的]研究DPC(缩节胺)浓度处理对棉花生理生化特性的影响.[方法]试验在石河子大学生防研究室进行,以新陆早44号为材料,用6个不同浓度DPC(缩节胺)(0、25、50、100、200和400mg/L)处理棉花,测定棉叶中叶绿素含量、MDA 含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、游离脯氨酸含量、POD 活性、SOD 活性以及CAT活性的变化.[结果](1)DPC处理前期叶片中叶绿素、游离脯氨酸和可溶性蛋白的含量都高于对照,随着浓度的增大,游离脯氨酸含量和可溶性蛋白质含量逐渐增大.而DPC处理后期叶片中叶绿素和游离脯氨酸含量都低于对照;(2)叶中MDA含量一直低于对照,随着浓度的增大,MDA含量逐渐减小;(3)并不能使棉花叶中可溶性糖含量发生变化;(4)DPC处理前期,SOD活性高于对照,而后期低于对照;DPC处理前期,POD活性和CAT活性低于对照,而后期高于对照.[结论]适当浓度的DPC(缩节胺)处理能增加棉花细胞耐渗透压能力,增强棉花抗胁迫能力,提高棉花叶片的抗旱能力,并提高棉花叶片的光合作用.     

棉花各生育期精细水肥调控对滴灌棉田土壤盐分变化的影响

[目的]滴灌棉田土壤次生盐渍化逐渐成为生产中关注的一个问题.探讨棉花生育期水肥调控对滴灌棉田土壤盐分变化的影响.[方法]在新疆库尔勒市进行大田试验,在总施肥量相同情况下棉花各生育阶段施肥比例不同时,测定分析各生育期剖面土壤电导率、水分含量、棉田光照强度.[结果]棉花生长期进行适宜的水肥耦合管理有可能在生长期结束时降低或调控表层土壤含盐量.在各生育阶段施肥量一定、需要多次追肥情况下,蕾期采取"前重后轻"、花铃期前期采取"多次等比例"、盛铃期采取"前轻后重"施肥策略,能有效降低0～60 cm根层土壤盐分含量.[结论]调控棉花生长增大田间郁闭程度有利于提高土壤水分含量、降低土壤含盐量.     

盐碱胁迫对不同棉花品种生长及离子组含量分布的影响

【目的】 分析盐碱胁迫对棉花生长、生理及离子平衡的影响,从离子平衡角度研究棉花抗盐性的内在机制。【方法】 以鲁棉研24号与新陆早45号棉花为材料,设置无盐(CK)、混盐(SA)2个盐度。【结果】 盐碱胁迫下,鲁棉研24号与新陆早45号的生长及光合作用受明显抑制,相对电导率、丙二醛和脯氨酸含量显著增加。鲁棉研24号叶中P含量显著增加了55.80%,新陆早45号无显著变化。 鲁棉研24号与新陆早45号各器官中的Na含量均显著增加,鲁棉研24号茎、根中K含量分别显著增加了25.20%、26.04%,叶中K及植株总体Ca、Mg含量有所下降。鲁棉研24号与新陆早45号地上部分Zn、Al、Mn、Mo含量显著增加,地下部分显著降低。【结论】 盐碱胁迫下新陆早45号较鲁棉研24号吸收了更多的Na,导致植物对N、P、K、Ca、Mg等离子的选择性吸收能力降低,且鲁棉研24号较新陆早45号具有更强的将各离子向地上部分运输的能力,提高自身在盐碱胁迫下的耐盐性。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析#br#

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号：GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号：GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72 bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析

【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7,分析其结构和功能,研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列,获得1个含有NAM结构域的EST,使用Oligo6.71设计引物,重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构,使用在线工具Plant CARE分析启动子序列,利用在线工具Gen Scan进行氨基酸序列翻译。同时,利用拟南芥基因组数据库(TAIR)进行序列比对,选取得分较高的NAC家族基因,使用MEGA 6.06软件和Gene Doc软件进行进化树分析和氨基酸比对。以XbaⅠ和SacⅠ为酶切位点构建35S::GhNAC7-GFP融合表达载体,分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术分析GhNAC7在棉花不同组织、不同叶片发育时期以及在200μmol·L~(-1) ABA调控下的表达量。通过构建p GhNAC7-GUS融合表达载体并转拟南芥,分析其启动子特异性。以Eco RⅠ和SalⅠ为酶切位点,利用p BI101和p BI121载体,分别构建融合表达载体并转拟南芥进行过表达分析。【结果】从陆地棉中成功克隆GhNAC7,其全长为1 064 bp,包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析结果表明,GhNAC7开放阅读框为834 bp,可编码277个氨基酸,其蛋白质分子量为31.35 k D,等电点为9.22。结构域分析表明其属于NAC转录因子的NAM亚家族,进化树分析显示GhNAC7与ANAC041、ANAC083同源性最高,其中,GhNAC7与ANAC083结构域位置均为17—58 aa。其启动子核心元件包含一系列与衰老、激素、胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位表明其蛋白为核蛋白。组织特异性表明GhNAC7在真叶、子叶、花、花药和衰老真叶中均明显表达,其中在衰老的真叶中表达量最高。启动子特异性分析表明,其GUS活性在衰老的叶片中最强。在拟南芥中过表达该基因,转基因植株比野生型表现出明显的衰老症状。荧光定量PCR分析表明,ABA处理后6 h GhNAC7明显上调表达,并在48 h表达量达到最高,这表明ABA可调控GhNAC7表达从而调节棉花叶片衰老。【结论】GhNAC7可以促进棉花叶片衰老并受ABA的调控。     

基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

【目的】研究Cry1Ac蛋白通过棉花、棉蚜的传递对普通草蛉酶活性及生长发育的影响,为转Bt基因棉花的安全性评价提供参考和依据。【方法】采用ELISA方法,检测Bt棉、取食Bt棉的棉蚜和捕食棉蚜普通草蛉体内Bt杀虫蛋白含量;通过酶活力测定普通草蛉幼虫取食Bt棉花上棉蚜后其体内的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的酶活性;室内生物测定普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后对其生长发育的影响。【结果】Cry1Ac杀虫蛋白在棉叶中的表达量为788.76 ng/g,远高于棉蚜体内的2.35 ng/g,取食Bt棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白;通过三级营养传递的Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力影响甚微。【结论】棉蚜取食Bt棉花后体内仅能累计微量Cry1Ac蛋白;普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后,对其体内三种酶活性和生长发育均没有负面影响。