金鱼Tgf2转座酶的原核表达及其DNA结合活性

金鱼Tgf2转座子基因属于Hobo/Activator/Tam3（hAT）超家族,其编码的活性转座酶能在多种鱼类转座中介导基因插入及诱变,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前景。鉴于Tgf2转座酶基因（JN886591）存在众多稀有密码子,本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性,对金鱼Tgf2转座酶基因进行密码子优化,所得Tgf2转座酶基因连接原核表达载体pET-28a（+）,将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞。该大肠杆菌细胞在培养温度37℃、OD₆₀₀≈0.5时用IPTG诱导获得高效表达,即菌体中含有8.8%的重组蛋白,上清液中含有4.0%重组蛋白。采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到分子量约70 ku的可溶性重组蛋白,经MALDI-（TOF）/TOF串联质谱鉴定其为重组Tgf2转座酶。进而采用分子排阻色谱法研究转座酶的DNA结合活性,结果表明：所得重组Tgf2转座酶能识别并结合含Tgf2转座子特异性亚末端重复序列的DNA探针,即启动转座。采用原核表达体系高效获得重组Tgf2转座酶,为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础。     

鱼类活性DNA转座子的发掘与应用概况

转座子(transposon)是基因组上的一段一定长度的DNA序列,能在自身编码的转座酶作用下,以"剪切-粘贴"的方式在基因组中进行高效转座。基于转座子的插入诱变策略,在包括鱼类在内的脊椎动物重要性状主控基因的筛选、功能解释以及基因组学研究方面有着重要的研究前景。长期以来,DNA转座系统在脊椎动物中的构建和应用都是空白,直到近十来年,随着青鳉Tol2、鲑SB、鲽Passport以及金鱼Tgf2等几例鱼类活性转座子的发现,开启了利用转座子工具在斑马鱼、小鼠等脊椎动物进行转基因和基因组插入诱变研究的新领域。介绍了鱼类DNA转座子的类型、结构特征及应用方面的最新研究进展,探讨了转座子在养殖鱼类重要性状主控基因的发掘、功能解释以及基因组学研究的可行性。     

高效PiggyBac转座酶的构建与筛选

【目的】构建能够定点转座的高效PiggyBac转座酶系统。【方法】以野生型PiggyBac转座酶为模板,通过易错PCR方法随机突变转座酶基因,构建转座酶突变库,并将其与能够靶向识别并结合DNA序列的锌指蛋白(ZFP)融合表达,构建ZFP-PiggyBac转座酶突变库系统。将转座酶载体突变库、转座子载体和报告载体共转到酿酒酵母JMY1中,通过Ura-5FOA酵母筛选系统筛选高效定点作用的转座酶。【结果】成功构建ZFP-PiggyBac转座酶突变库系统,经过3轮系统筛选获得5个高效作用的突变转座酶。【结论】新构建的ZFP-PiggyBac转座酶突变库系统具有在锌指蛋白ZFP靶向识别域Rosa26BS位点处进行高效转座的能力。     

海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上, DNA序列测定表明, 克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽. 将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG 诱导. 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白.     

Tgf2转座子介导鲤Fst1基因元件在鲤中的转基因效率研究

卵泡抑素(follistatin,Fst)蛋白具有拮抗TGF-β超家族许多成员的功能,通过直接的蛋白结合可抑制肌肉抑制素(myostatin)的活性,从而恢复肌肉的生长,表现出增肌效应。参照鲤高通量转录组测序数据的拼接结果,筛选出鲤卵泡抑素Fst1基因的编码框(ORF)序列(全长1 260 bp,编码320个氨基酸),构建了包含金鱼Tgf2转座子左臂(220 bp)、右臂(185 bp)、斑马鱼Mylz2启动子和鲤Fst1基因ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ccfst1。通过显微注射方法,并在体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA的介导下,获得了一批转鲤Fst1基因的转基因鲤。经PCR检测,转基因鲤Fst1外源基因的整合率平均为44.7%,对其中4尾转基因阳性鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证,结果表明阳性鲤中均含有转基因目的片段。说明Tgf2转座子转基因系统可在鲤中实现较高的转座效率,为进一步研究卵泡抑素在鲤肌肉发育中的功能奠定了基础。     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

切刻核酸内切酶PNE45的原核表达与活性鉴定

【目的】对大肠杆菌噬菌体phiV10第45个基因编码蛋白PNE45进行原核表达,并检测其酶活性。【方法】设计并合成10段密码子优化的寡核苷酸序列,采用重叠延伸PCR技术,将其拼接克隆,获得人工合成的PNE45基因,然后将其整合入含有MBP纯化标签的pET21a原核表达载体中,构建重组载体pET21a-MBP-PNE45,诱导表达后获得融合蛋白MBP-PNE45。利用Amylose亲和层析纯化融合蛋白MBP-PNE45,以pUC19为底物,分别在Mg2+和Mn2+参与下对MBP-PNE45活性进行初步鉴定。【结果】融合蛋白MBP-PNE45主要以可溶性形式表达,其表达量占细胞总蛋白的35%左右。PNE45融合蛋白在Mg2+缓冲液中具有DNA随机切刻活性,在Mn2+存在时还具有切刻位点对位切刻活性。【结论】首次成功表达并制备了PNE45,并初步证明其是一种新的随机性切刻核酸酶。     

人源弹性蛋白酶基因原核载体构建及表达

从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中.然后用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对重组质粒pGEM-T easy/ELA2B和大肠杆菌E.coli表达质粒pET30a进行双酶切,成功构建了原核表达载体pET30a/ELA2B.将重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21中,通过PCR和表型鉴定表明,ELA2B基因已经整合到大肠杆菌BL21染色体上.用IPTG对重组的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到的蛋白经SDS-PAGE分析结果表明:菌体中含有一明显特异性蛋白,大小为28 kD.经包涵体复性后在弹性蛋白酶活性检测平板上发现有代表弹性蛋白酶作用的透明圈产生,可初步证实表达产物具有生物活性.     

马铃薯卷叶病毒CP基因的突变及其原核表达

通过人工合成DNA的方法,对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因第52～177核苷酸(126bp)这段序列进行了突变,将其中12个AGA、AGG、CGA等精氨酸稀有密码子变成了原核高效表达的同义密码子CGT与CGC,将另外两个AGA精氨酸密码子变成了错义密码。构建了突变基因的原核表达载体pBAD-LRCP2,Bsp1407Ⅰ与MssⅠ酶切及DNA测序结果表明,基因突变符合要求,表达载体的构建正确。在37℃,大肠杆菌工程株TOP10(pBAD-LRCP2)用0.2%L-阿拉伯糖诱导培养4h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条36ku的诱导表达的融合蛋白条带,结果表明突变基因在PBAD启动子驱动下在大肠杆菌中实现了表达。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

家蚕表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及其与几丁质的结合特性

【目的】探讨家蚕(Bombyx mori)表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及与几丁质的结合方式,为家蚕表皮蛋白的功能研究提供依据。【方法】应用生物信息学方法分析家蚕CPAP家族表皮蛋白及BmCPAP3-G的结构域的序列特征;利用原核表达的方法表达BmCPAP3-G的融合蛋白,通过镍柱亲和层析技术纯化可溶性蛋白,利用5800 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定正确后进行多克隆抗体制备,并利用几丁质亲和层析技术验证BmCPAP3-G与几丁质的结合;利用半定量RT-PCR和Western blot方法对BmCPAP3-G的组织和时期表达情况进行检测;利用几丁质亲和层析技术探讨体外BmCPAP3-G的结构域与几丁质结合能力强弱的关系。【结果】BmCPAP3-G蛋白具有18个氨基酸组成的信号肽,分子量为27 k D,等电点为4.82,位于第15号染色体上,由3个相同的Cht BD2结构域组成,并且其结构域中的半胱氨酸和芳香族氨基酸的同源性较高;对BmCPAP3-G进行了克隆和原核表达,并利用镍柱亲和层析技术纯化到了较纯的可溶性蛋白,经5800 MALDI-TOF/TOF鉴定正确后制备了其多克隆抗体,通过几丁质亲和层析技术验证了BmCPAP3-G能够与几丁质进行结合;利用半定量RT-PCR和Western blot的方法对BmCPAP3-G的组织和时期表达情况进行检测,发现转录水平和蛋白水平的结果一致,BmCPAP3-G在头和表皮中的表达量较高,在中肠、生殖腺和丝腺中的表达量较低,从表皮和丝腺的时期表达情况分析BmCPAP3-G在4龄眠期的表达量最高,随着5龄期的进行表达量呈逐渐下降的趋势;为了探讨BmCPAP3-G结构域与几丁质结合的关系,对该蛋白的结构域进行原核表达及镍柱亲和层析纯化,成功纯化了有活性的结构域3、结构域1-2、结构域2-3,将这3个结构域进行几丁质亲和层析验证其与几丁质的结合能力,发现它们均能够与几丁质进行结合,但是结合能力有差异,结构域3相比于结构域1-2和结构域2-3的结合能力要弱,即两个结构域比单个结构域与几丁质的结合能力强。【结论】BmCPAP3-G为典型的CPAP家族的表皮蛋白,可能参与几丁质层在眠期的降解再形成过程。BmCPAP3-G单个Cht BD2结构域就能够与几丁质结合,但多个结构域的同时存在加强了其与几丁质的结合能力。     

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。     

RSV编码的4种蛋白在“AcMNPV-sf9昆虫细胞”体系中的重组表达

应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP).序列测定表明,目的基因准确地插入到表达载体中.重组质粒pFastBacHTb-X通过转化包含有穿梭载体的大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH10Bac,得到重组穿梭质粒rb-X(rb-NS2、rb-NS3、rb-CP和rb-SP).rb-X侵染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞(sf9)24-72 h后,在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到细胞增大、培养液和细胞内出现颗粒状物质、部分细胞破裂甚至裂解等一系列与正常sf9细胞形态有明显区别的现象.rb-X侵染细胞72h后,从细胞提取蛋白,电泳分析得到4个条带,大小分别为28.2、29.2、40.2和25.2 ku,与预测的4种融合蛋白大小一致.Western blotting分析分别得到4条单一条带,证明了RSV NS2、NS3、CP和SP基因在"AcMNPV-sf9昆虫细胞"真核表达体系中成功表达.     

水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定

纤维素合酶是参与纤维素β-1,4-葡聚糖链延伸的主要催化亚基,为进一步研究水稻中纤维素合酶的作用机理,采用DNA重组技术,将纤维素合酶基因CesA1、CesA2、CesA3克隆入表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒.在大肠杆菌JM109中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后在原核细胞中成功表达了3种纤维素合酶的...     

鱼类体表粘液分泌机制·组分与功能研究进展

鱼类体表粘液来自体表粘液细胞,其成分和量受到粘液细胞的分布、数量、发育情况以及外界环境的影响。粘液的主要成分是粘多糖和蛋白类,同时还含有少量脂质。多糖类作为生物活性物质,在抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等方面起到了重要作用。蛋白类的含量达55%,主要成分为88~95 kD的免疫球蛋白、溶菌酶、凝集素、补体、抗病毒蛋白/肽以及SOD酶,在鱼类的生命活动中有着重要意义。分离鱼类体表粘液中生物活性蛋白的方法主要有柱层析法、盐析法、离子交换层析法等。结合国内外研究成果,对鱼类体表粘液分泌机制、粘液的组分及Ig的分离、体表粘液的免疫功能研究和趋势等方面进行了综述,旨在为今后体表粘液免疫蛋白的应用研究提供切入点。     

石楠不同部位提取物抗氧化活性

为考察石楠(Photinia serrulata Lindl.)抗氧化活性与总原花青素、总酚和总黄酮质量分数之间的关系以及提取溶剂对其抗氧化活性的影响,采用不同溶剂对石楠不同部位进行了超声提取;测定了总原花青素、总酚和总黄酮质量分数;以DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、铁离子还原能力和铜离子还原能力综合评价了其抗氧化能力。结果表明:石楠不同部位抗氧化能力差异显著,枝-韧皮部和果序-轴抗氧化活性最强,这与高质量分数的总原花青素、总酚和总黄酮有关;不同溶剂的提取效果具有显著性差异,枝-韧皮部的总原花青素质量分数为(10.77±0.08)%~(29.31±0.69)%;总黄酮质量分数为(2.60±0.02)%~(7.02±0.01)%;总酚质量分数为(3.15±0.02)%~(6.42±0.07)%,其中85%甲醇提取总原花青素效果最好,70%丙酮提取总酚和总黄酮效果最好。相关性分析表明,石楠不同部位总原花青素、总酚和总黄酮质量分数与抗氧化活性之间呈现极显著正相关(P0.01),说明石楠总原花青素、总酚和总黄酮可能作为石楠抗氧化成分协同发挥抗氧化活性。     

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(Chicken Interleukin 2,ChIL-2)融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL-2作为分子免疫佐剂对IBDV DNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.     

利用SUMO系统高效表达可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白

利用pCold-SUMO可溶性原核表达载体,构建表达猪圆环病毒2型缺失核定位信号肽的Cap基因的重组表达载体pCold-SUMO-dCap,并将其转入Arctic-Express表达菌株中15℃低温诱导表达.表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明SUMO-dCap融合蛋白获得了高效表达,可溶性SUMO-dCap融合蛋白约占总融合蛋白的50%;用NI-NTA树脂纯化可溶性的融合蛋白,然后利用SUMO蛋白酶特异性去除SUMO标签,从而得到不含任何标签的dCap蛋白,进一步的Western-blot分析表明,表达的dCap蛋白具有良好的反应原性.     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。