Ⅲ型分泌装置蛋白HrcJ决定条斑病菌在植物上的过敏反应和致病性的研究

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因编码形成的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS),将致病性效应分子注入水稻细胞中,但Xooc的hrcJ基因在致病性中的作用以及其如何参与形成T3SS分泌装置,并不明确。【方法】本研究根据标记交换原理对Xooc的hrcJ基因进行了敲除。【结果】发现hrcJ突变体丧失在水稻上的致病性和在烟草上的HR激发能力。酵母双杂交显示,HrcJ蛋白N端脂蛋白结构域可与HrcC互作,HrcJ蛋白C端跨膜结构域可与HrcV互作,提示HrcJ蛋白联接于T3SS装置的内膜和外膜之间。功能互补结果显示,缺失脂蛋白结构域和跨膜结构域的hrcJ基因均不能恢复hrcJ突变体在烟草上的HR激发能力和在水稻上的致病性。RT-PCR结果显示,hrcJ的表达受hrpX基因调控,hrcJ基因突变后不影响效应分子hpa1的表达。【结论】hrcJ基因是水稻条斑病菌致病性和非寄主上激发HR的关键因子,其基因产物参与了T3SS装置的形成。     

水稻条斑病菌xopQ1_(Xoc)在病程中功能的初步研究

【目的】基因组学揭示,水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)中存在与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)中通过Ⅲ型分泌系统分泌的HopQ1-1同源的XopQ1Xoc,但其是否为T3S效应分子以及在病菌致病性中的功能并不清楚。【方法】通过基因敲除技术,获得了水稻条斑病菌xopQ1Xoc的突变体。【结果】致病性测定结果发现,xopQ1Xoc突变后,病菌在水稻上的毒性增强,细菌生长能力增强。非常有意义的是,xopQ1Xoc突变体菌液浓度为3×108CFU/mL时仍能在烟草上激发过敏反应,但在浓度为104CFU/mL时,8d后可在烟草上产生坏死症状。功能互补结果显示,xopQ1Xoc能够恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力。Western杂交结果显示,XopQ1Xoc不能通过T3S装置进行分泌。【结论】XopQ1Xoc是水稻条斑病菌T3S效应分子,可能作用于植物的免疫系统,有利于病害的发展。为进一步揭示水稻-黄单胞菌互作的分子机理提供了科学线索。     

烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssb_x互作因子的鉴定

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SsbX)通过病原菌III型分泌系统(type-III secretion system,T3SS)分泌,在非寄主植物烟草上产生过敏反应(hypersensitive response,HR),研究旨在明确SsbX激发烟草产生HR的机理。【方法】将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片,应用CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建水稻和烟草cDNA文库,借助pGADT-Sfi AB载体上特殊酶切位点SfiⅠ,酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量;以SsbX为诱饵,通过酵母双杂交技术(Y2H)从水稻和烟草cDNA文库中筛选在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上能够生长的阳性克隆;并利用β-gal试验验证阳性克隆;序列测定后,使用MEGA 4序列分析软件,并利用邻位相连法(neighbor-joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同源序列和系统进化树分析;利用荧光双分子互补试验(BiFC)于488 nm处黄色激发光和520—550 nm透射光、20×物镜下,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5-II)观察SsbX与烟草和水稻中互作因子的互作位点。【结果】水稻和烟草cDNA文库构建和质量检测结果显示,随机挑选20个克隆中水稻来源的cDNA插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.0kb;随机挑选20个克隆中烟草来源的cDNA均插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.2 kb,说明水稻和烟草的cDNA文库构建质量较好;Y2H和β-gal试验结果显示,SsbX可与烟草和水稻的ADF2(actin-depolymerization factor 2)蛋白互作,使酵母AH109能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长,并且β-gal染色显示为蓝色。水稻Os ADF2编码139氨基酸,蛋白质分子量为15.9 k D,而烟草Nb ADF2编码137氨基酸,蛋白质分子量为15.kD,两者同源性达69.02%。同源性以及系统进化树分析显示,植物中ADF2广泛存在,同源性高达60%以上。双子叶植物烟草和拟南芥的ADF2同源性最高,相似性达69.05%;单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高,相似性为88.81%。BiFC试验结果显示,在488 nm波长的激光共聚焦显微镜下,仅SsbX和Os ADF2以及SsbX和Nb ADF2共同存在时,可在烟草细胞膜上显示黄色荧光,与阳性对照显示黄色荧光一致,说明SsbX可与Os ADF2或Nb ADF2互作,互作位点发生在植物细胞膜上。【结论】通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的SsbX,在植物细胞膜上与ADF2互作,从而激发植物的免疫性。这为进一步揭示SsbX如何激发植物产生HR的机制提供了依据。     

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。     

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases,endoPGs）是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框（ORF）长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作（接种）之后该基因的表达与未互作（不接种）的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】 烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。     

水稻白叶枯病菌hisF基因的克隆及功能初析

根据黄单胞菌hisF基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中克隆了hisF同源基因,命名为hisFXoo.NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,HisFXoo属于组氨酸生物合成蛋白家族的一员,具有与其他HisF蛋白相似的结构.序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的.同源性搜索比较显示,与水稻条斑病菌(Xoryzae pv.oryzicola,Xooc)的hisF(登录号:DQ372107)同源性高达98%.通过同源重组的方法,构建了hisFXoo的插入突变体,在NA+Amp平板上筛选后,并且经过PCR及Southern杂交验证插入正确.在MMX基本培养基中生长测定发现,hisF突变体生长能力明显下降,证明hisF基因与Xoo生长代谢相关.但是,该突变体仍具有致病性,并且毒力与野生型菌株没有明显差异.     

模块化质粒系统用于水稻条斑病菌基因表达的分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。近几年,在我国南方水稻产区,条斑病大面积发生,对水稻的安全生产构成严重威胁。为了准确地在Xoc中进行基因功能的分析,本研究设计出模块化的质粒系统,用于基因转录表达和蛋白表达的分析。为了验证该系统的可行性,选取hrpG、hrpX和hrpB1基因构建了相应的启动子载体和蛋白表达载体,将这些载体导入相应的hrp调控子基因trh、hrpG和hrpX的突变体中。GUS活性测定的结果显示,在XOM3培养基、寄主水稻组织和非寄主烟草组织中,启动子模块元件能够准确反映这3个hrp基因的调控表达模式。蛋白免疫杂交结果显示,HrpX蛋白表达水平反映的调控模式与hrpX启动子活性呈现的调控表达模式一致。水稻上致病性测定结果显示,有效表达的HrpG蛋白能够恢复hrpG突变体在寄主水稻上的致病性。这表明,这套模块化的载体系统能够有效应用于基因转录表达、蛋白表达和功能互补的分析。这将为Xoc-水稻互作研究提供有效的技术支持,加快Xoc毒性相关基因功能的研究。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析

【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌（Dickeya zeae）双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应（HR）;进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

CgRGS7调控胶孢炭疽菌分生孢子产量、附着胞形成及致病性

【目的】G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白信号转导通路中的负调控因子,参与多个G蛋白信号通路介导的细胞内过程,目前对于胶孢炭疽菌相关RGS蛋白的生物学功能研究较少。【方法】本研究通过同源重组获得CgRGS7基因的敲除突变体,并对其生物学功能进行初步分析。【结果】CgRGS7基因编码620个氨基酸,具有7个跨膜结构域和1个RGS功能域。CgRGS7敲除突变体与野生型菌株相比,表现为分生孢子产量降低且孢子呈多端萌发,附着胞形成率下降以及致病性减弱。【结论】CgRGS7参与调控胶孢炭疽菌分生孢子产量,同时影响芽管的形态发育、附着胞形成及致病性。     

解淀粉芽孢杆菌Lx-11产脂肽类物质鉴定及表面活性素对水稻细菌性条斑病的防治作用

【目的】对解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的脂肽类物质进行分离鉴定和水稻条斑病防效测定。【方法】根据脂肽类抗菌物质合成相关基因序列对Lx-11进行PCR扩增检测,采用MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分析。【结果】通过3对特异性引物对Lx-11菌株检测,扩增产物经克隆、测序和BLAST分析,表明解淀粉芽孢杆菌Lx-11基因组中含有sfp、fenB、ituA或bamA基因。质谱分析发现提取的粗提物中含有surfactin、bacillomycin D和fengycin等3种脂肽类抗生素。通过构建surfactin突变体菌株,平板和盆栽试验显示突变体菌株抑制条斑病菌能力显著降低。【结论】解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的surfactin类物质对条斑病菌具有较强的抑制作用,是抑制条斑病菌主要物质之一。     

水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物基因hpaF与毒力相关

【目的】稻黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)PXO99A菌株中PXO_03420基因被注释为编码具有多个LRR的Ⅲ型效应物基因hpaF,本研究旨在明确hpaF基因的功能,为完善XooⅢ型效应物的研究提供一定的理论基础.【方法】通过同源双交换构建hpaF基因的缺失突变体,并通过表型分析、致病性试验和遗传互补对该基因的功能进行研究.【结果和结论】本研究发现,hpaF基因突变后对水稻日本晴品种的致病力降低了51.81%,减弱了细菌在非寄主植物蓖麻上的过敏反应.而带有hpaF全基因片段的pLAFR3能够恢复hpaF突变体的致病表型,结果表明hpaF基因与水稻白叶枯病菌的致病性相关.     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点，把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上，获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上，获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105，把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99，通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现，lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示，基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关，前两基因的突变导致细菌完全失去毒性，而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型，在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此，本试验证明，以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

受条斑病菌侵染的水稻cDNA文库构建

提取经条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)侵染诱导后的水稻mRNA,利用SMARTTM技术于载体pGADT7-SfiAB上构建了水稻cDNA文库.检测发现,文库中含有水稻病程相关蛋白基因OsPR-1a、OsPR-1b和PAL.随机提取cDNA文库克隆的质粒,酶切分析发现,该cDNA文库的插入片段分布在500～2 000 bp之间,平均大小约为1 kb,重组率达95%.上述结果表明,水稻受条斑病菌侵染的cDNA文库质量较好,这为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定了工作基础.     

非寄主植物烟草中与大豆疫霉菌激发素互作蛋白质的筛选

【目的】采用酵母双杂交技术,从非寄主植物烟草中筛选与大豆疫霉菌类激发素PSE7和激发素SO-JB互作的蛋白。【方法】以PGBKT7-PSE7和PGBKT7-SOJB为诱饵质粒筛选烟草cDNA文库,得到的阳性克隆经测序后,在NCBI上进行Blast分析。【结果】PSE7和SOJB在烟草中存在几个相似的结合蛋白,表明二者具有共享的生物学功能;SOJB能与肽酶和泛素结合蛋白(与蛋白质降解有密切关系)互作,而PSE7没有筛选到类似蛋白;SOJB和PSE7均能与跨膜运输蛋白结合,PSE7与水通道蛋白结合,SOJB与铜离子转运蛋白结合,表明二者在胞质内均存在作用靶标。【结论】PSE7和SOJB最终分别从烟草中筛选出9和13个阳性互作蛋白。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

桉树焦枯病菌SIT转运蛋白的鉴定与表达

【目的】揭示SIT转运蛋白家族在焦枯病菌铁元素摄入机制,以及铁载体-铁转运蛋白在焦枯病菌侵染桉树过程中所扮演的角色。【方法】采用HMMER软件对焦枯病菌SIT转运蛋白进行鉴定,并用InterPro、TMHMM、TCDB数据库等的在线服务对焦枯病菌SIT转运蛋白的结构域、跨膜螺旋和功能进行预测,用MEGA7.0软件进行多菌种比较分析,最后采用qPCR对焦枯病菌侵染桉树48h时SIT基因的转录表达情况进行验证。【结果】桉树焦枯病菌共含有16个SIT转运蛋白,约占总编码蛋白的0.11%,主要分为铁-铁载体转运蛋白、铁载体-铁:H+同向转运蛋白和铁载体-铁转运蛋白;亚细胞定位预测结果显示,除预测CpSit13转运蛋白位于内质网上外,其余均在细胞膜上。桉树焦枯病菌SIT转运蛋白的序列长度为400～603aa,其结构域均为MFS结构域,跨膜螺旋为10～14个。基因表达谱分析显示,有10个SIT基因上调表达,有2个下调表达,有4个表达不显著。其中CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16相对分支中其他基因具有较高的转录量。qPCR验证结果与基因表达谱具有较高的一致性。【结论】CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16基因在焦枯病菌侵染桉树过程中具有较为重要的作用。     

抗蔓枯病甜瓜突变体edr2抗病现象的初步研究

 【目的】蔓枯病常引起甜瓜毁灭性的损失,研究甜瓜与蔓枯病菌互作的功能基因对选育抗蔓枯病的甜瓜品种是非常重要的。【方法】采用农杆菌侵染子叶外植体的方法产生T-DNA插入的甜瓜突变体,人工气候箱内离体和大棚内幼苗接种蔓枯病菌,筛选蔓枯病抗性增强的突变体株系,并且初步研究该突变体的抗病机制。【结果】一个蔓枯病抗性明显增强的突变体,命名为edr2,该突变体是T-DNA单拷贝插入甜瓜染色体引起的,edr2的蔓枯病抗性和标记基因卡那霉素抗性基因共分离。蔓枯病菌在突变体甜瓜edr2上的侵染过程与在野生型甜瓜上相比,分生孢子萌发率降低、芽管的伸长和菌丝的生长较迟缓。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突变体发生细胞程序性死亡,但是不引起野生型甜瓜的细胞发生程序性死亡。【结论】edr2突变体抗性增强,不但抑制病菌在植株体内的生长,并且诱导自身的抗性。本研究为选育抗蔓枯病的甜瓜品种提供了新的思路,为挖掘甜瓜－蔓枯病菌互作的基因提供支持。     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆｃ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆量个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。