禾谷孢囊线虫果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鉴定与表达特征分析

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,并使用MEGA 5.0构建系统进化树;采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1(Gen Bank登录号GQ998895),该基因c DNA全长1 717 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为57.5 k D,理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长,基因结构显示分析发现,Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子,除第3个内含子剪接位点是GC-AG外,其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明,预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性;此外,其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列,这段序列中,靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性,而靠近C端有70个氨基酸残基(Lys205—Glu274)与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白(注册号3ELD)的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现,预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族(PL3)的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基;系统进化分析发现,Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中;原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达;半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析,揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。     

大豆孢囊线虫扩展蛋白新基因(Hg-exp-1、Hg-exp-2)的鉴定及功能分析

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。     

金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）的克隆及序列分析

 【目的】克隆金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）,分析其序列特征。【方法】利用同源克隆的原理,采用RACE结合cDNA文库筛选的方法,从金荞麦cDNA文库中克隆DFR基因（FdDFR1）;对其序列进行生物信息学分析和Southern杂交检测。【结果】克隆到一个DFR蛋白基因（FdDFR1）,通过Southern杂交分析,推测在金荞麦基因组中DFR基因是1～2个基因的小家族,FdDFR1是单拷贝基因;FdDFR1基因编码一个长341个氨基酸的蛋白质,在N端存在一个NADP结合位点“VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY”,还存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”。【结论】首次从金荞麦中克隆到类黄酮代谢的中期关键酶基因（FdDFR1）,它具有DFR同源基因的典型特征。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

南方根结线虫诱导辣椒基因CaRKNIF2的克隆与分析

 【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

魔芋软腐病pelD和pelE基因的克隆与表达分析

【目的】为探明魔芋软腐病病原菌的致病机理和更好地防治该病,摸清果胶酸盐裂解酶在软腐病致病过程中的作用。【方法】以魔芋软腐病菌为材料,通过PCR克隆技术获得魔芋软腐病中重要的果胶盐裂解酶基因,对克隆的基因进行相关生物信息学分析,并通过构建原核表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。【结果】获得具有完整阅读框的魔芋软腐病pelD和pelE基因,2个基因均在约45 ku处出现明显的条带,2个基因诱导后酶活性均明显升高,pelD和pelE诱导后酶活分别是诱导前的1.79和1.75倍。【结论】研究获得具有正常功能的魔芋pelD和pelE基因,为深入研究此2个基因的功能奠定了基础。     

Hs1 pro-1双子叶表达载体构建和转化大豆研究初报

用从德国引进的抗线虫基因Hs1pro-1构建表达载体并转化大豆,以获得抗线虫转基因植株.提取克隆载体p1832,用Nco 酶切、Klenow补平和Sac 酶切,回收基因片段;提取表达载体pBI121,用Sma 和Sac 酶切,回收大片段;目的片段用T4DNA连接酶连接并转化E.coli,鉴定重组质粒;用基因枪轰击转化大豆品种早熟1号,获得18株再生苗,其中3株经PCR检测呈阳性,通过Southern杂交,证明Hs1pro-1基因已整合到其中2株大豆的基因组中.     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定

【目的】在江西婺源县孢囊线虫调查中,从大豆根及根际土壤中采集到一个孢囊线虫群体,其形态特征和分子特征与大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)存在较大差异,因此对其形态学和分子特征以及寄生性等进行详细研究,以明确其种类及对豆科作物寄生性,为病害防控提供科学依据。【方法】从婺源县采集的大豆根及根际土样,用筛淘法分离孢囊,大豆根系上的孢囊用直接解剖法获取。用浅盘法分离根际土样中的2龄幼虫和雄虫。选取具典型特征的饱满孢囊制作阴门锥切片,浅盘法分离的2龄幼虫和雄虫制作永久玻片,在显微镜下观察记录孢囊、2龄幼虫和雄虫的形态特征,并进行形态特征测量。采用两对植物线虫通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分别扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和28S大亚基D2-D3区段,经序列测定,用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining(NJ)method)构建该线虫群体与孢囊线虫属其他种群的ITS和LUS D2-D3系统进化树,分析其系统发育关系。在温室内采用盆栽人工接种的方法,测定江西孢囊线虫群体对11种豆科作物的寄生性,同时测定国内40个大豆栽培品种对该孢囊线虫的抗病性。【结果】形态学观察和特征值测量结果表明,从江西婺源大豆上采集的孢囊线虫群体,其孢囊形态、2龄幼虫以及雄虫的形态特征与野生豆孢囊线虫(Heterodera sojae)的形态特征基本一致;ITS序列(MG859982)比对发现其与野生豆孢囊线虫ITS序列(KU160510和KU160512)的同源性为99%和98%,而与大豆孢囊线虫ITS的同源性仅为81%(KY794762.1)。D2-D3序列(MG859981)与野生豆孢囊线虫(KU160511)相似度最高,为99%。序列系统进化树分析发现以ITS序列与D2-D3序列构建系统发育树的结果相一致,江西孢囊线虫群体与野生豆孢囊线虫分布在同一支,节点支持率为100%,而与大豆孢囊线虫聚在另一个分支中。结合形态学和分子生物学结果,将江西婺源大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种。寄生性研究结果表明,在参鉴的11种豆科作物中,野生豆孢囊线虫的2龄幼虫能在大豆和相思豆(红豆)上侵染和繁殖,完成生活史;虽然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8种作物根系,但不能完成生活史。测定的40个大豆栽培品种中,19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。【结论】在我国江西婺源新发现的一种寄生于大豆的孢囊线虫为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种;人工接种条件下相思豆(红豆)也是野生豆孢囊线虫的寄主,40个大豆栽培品种中30个对该孢囊线虫表现感病。     

大豆蚜羧酸酯酶基因AgCarE的克隆、表达及活性分析

【目的】克隆大豆蚜羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究大豆蚜抗药性机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术,克隆了1个大豆蚜羧酸酯酶基因的全长cDNA序列,命名为AgCarE,利用生物信息学软件及网上工具进行序列分析,以pET-21b为载体构建原核表达系统进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因AgCarE（GenBank登录号：JF970181）全长1 946 bp,编码526个氨基酸。羧酸酯酶AgCarE的等电点（pI）为6.08,蛋白活性中心包括3个氨基酸残基（催化三联体）：Ser186、Glu313、His434,5个N-联糖基化位点,具备羧酸酯酶的结构特征,属羧酸酯酶家族（EC: 3.1.1.-）。将该基因编码序列与pET-21b载体重组,经IPTG诱导表达HIS标签融合蛋白、SDS-PAGE分析和Western-blot检测,在大肠杆菌BL21中成功表达约59 kD的AgCarE蛋白,以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.036 mmol/100 μL酶液。【结论】成功克隆、表达了大豆蚜羧酸酯酶蛋白AgCarE,以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.036 mmol/100 μL酶液,有助于进一步了解羧酸酯酶的结构特征及水解作用,为设计研发新型杀虫剂提供可能。     

大豆根内胞囊线虫发育进程及分布

 【目的】明确山东大豆胞囊线虫在大豆根系内的发育进程和动态分布为该病的防治提供最佳防控区域和最佳防治时期,于2007年和2008年对大豆根内胞囊线虫(4号生理小种)进行发育进程及动态分布的监测。【方法】采用网袋法收集根系,酸性品红-次氯酸钠法对根染色,体视显微镜下统计根内各龄期线虫数量。【结果】两年大豆根内胞囊线虫密度呈相同趋势,均为“S”型变化。二龄幼虫(J2)、三龄幼虫(J3)和四龄幼虫(J4)的动态发育规律一致,出苗后4～5周出现峰值,各龄期幼虫在不同土层均有分布,主要集中在5～15 cm土层根系内,均以J2为优势虫态。【结论】在山东省土壤平均温度为20～22.2℃的条件下,大豆胞囊线虫第1个世代需22～35 d的时间,完成1个生活史最短需22 d。防治该病的药效持续期为出苗后1个月左右,作用范围集中于5～15 cm土层。     

大豆和烟草上大豆孢囊线虫田间侵染特征比较分析

【目的】测定和分析2013年同一生长季大豆和烟草上大豆孢囊线虫（Heterodera glycines,SCN）的群体动态和世代发生特点,探讨2种作物对大豆孢囊线虫的寄主适合性差异和温湿度等气象条件对线虫发生的可能影响。【方法】采取“Zig-Zag”取样法对同一地点2种作物上的大豆孢囊线虫每隔6-8 d同时取样,用淘洗-过筛法和贝曼漏斗法分离土壤中线虫,用次氯酸钠-酸性品红染色法对根组织中线虫染色,镜检并计数。统计作物生长季每旬100 g土壤和10 g根组织中各虫态的数量,即群体密度。【结果】在大豆和烟草土壤中,大豆孢囊线虫2龄幼虫均出现于4月7日至9月15日,最大群体密度均发生在7月下旬,之前分别有2个和1个不明显发生高峰;白色雌虫最早均于6月3日出现,其群体密度在大豆土壤中于7月中旬和8月中旬有2个明显的发生高峰,而在烟草土壤中仅于6月份有1个较低水平的高峰阶段;孢囊群体密度均于7月中旬达到最大,之后在大豆土壤中一直保持较高水平,而在烟草土壤中逐渐下降到极低水平。在大豆和烟草根组织中,2龄幼虫最早均出现在5月19日,其群体密度在大豆根组织中出现3个明显高峰,分别发生在5月下旬、6月下旬和7月中旬,而在烟草根组织中出现2个高峰,分别发生在5月中旬和6月下旬,前一高峰不明显;3-4龄幼虫最早分别出现在5月26日和5月19日,最大群体密度均发生在6月下旬,但在5月下旬和7月中下旬在大豆根组织中另有2个较不明显的发生高峰;年轻雌虫最早均于5月26日出现在根组织中。该生长季大豆孢囊线虫在大豆和烟草上的繁殖系数（Rf=Pf/Pi）分别为5.0和0.5。7月上旬之后,大豆孢囊线虫在大豆上继续发生侵入和根内发育,而在烟草上再无侵入,却有许多半埋生根内的空瘪小的褐色孢囊产生。【结论】在同一生长季,大豆孢囊线虫在大豆上发生3代,而在烟草上只发生2代;大豆孢囊线虫在大豆上的繁殖明显较好,大豆寄主适合性程度明显高于烟草。7月份烟草土壤中2龄幼虫不能侵入根系可能与持续过高的土壤湿度有关,而7、8月的高温似乎抑制大豆孢囊线虫在大豆上的世代进程。