用热休克法诱导虹鳟雌核发育二倍体的研究

采用经紫外线照射后遗传上失活的精子激活卵子,用热休克法诱导虹鳟Oncorhynchus mykiss减数分裂雌核发育二倍体。对影响诱导效果的紫外线照射精子的剂量及28℃热休克处理的持续时间和处理起始时刻进行了研究。结果表明:紫外线照射精子的最佳条件为照射距离8 cm、照度6 670μW/cm2、照射时间15 min;获得虹鳟减数分裂雌核发育二倍体的最佳参数为受精后20 min,28℃热休克处理10、15 min,雌核发育率为14.28%~37.75%。     

冷休克诱导黄河鲇(Silurus asotus)二倍体雌核发育

[目的]通过冷休克法诱导黄河鲇二倍体雌核发育。[方法]在水温23.5±0.5℃的条件下,用紫外线照射黄河鲇(Silurus asotus)精子,然后进行进行人工受精,设置不同的冷休克起始时间和持续处理时间,观察黄河鲇二倍体雌核发育。[结果]在紫外线照射15min、冷休克起始时间为受精后5 min、持续处理40 min的条件下得到的二倍体黄河鲇成活率最高,达8.5%。[结论]该研究为培育优良黄河鲇新品种奠定了基础,为深入研究雌核发育机理积累了原始资料。     

锦鲤人工雌核发育早期胚胎观察

以团头鲂灭活精子为诱导,采用热休克染色体加倍处理方法进行锦鲤雌核发育。锦鲤卵为黏性卵,置于(20±1)℃室内平皿孵化,50 min后开始卵裂,6 h后出现囊胚期,18.67 h后出现原肠胚期,30 h后出现神经胚期,39 h后器官开始形成,约3 d后可以脱膜孵化,孵化率达68.5%。     

金鱼雌核发育诱导的τ0度量法优化

引入相对胚龄τ0作为计时单位,通过系列试验确定热休克法抑制第一次卵裂的起始时间,以实现对金鱼（Carassius auratus）雌核发育诱导过程中的卵子染色体加倍操作进行优化的目的。研究结果表明,在固定热休克处理温度为38～39℃,热休克处理持续时间为2min的前提下,20℃、22℃和25℃三种不同预处理水温组的孵化率与正常仔鱼数量曲线都形成一个单一的峰,且均在3．4 τ0时达到最佳优化点,对应胚胎发育阶段为第一次卵裂中期。结果提示了以T0单位度量热休克处理时机的准确性以及该优化方法在鲤科鱼类雌核诱导操作中的通用性,从而为相关鱼类的雌核发育操作提供了有价值的资料。     

金鱼雌核发育诱导的τ0度量法优化

引入相对胚龄τ0作为计时单位，通过系列试验确定热休克法抑制第一次卵裂的起始时间，以实现对金鱼（Carassius auratus）雌核发育诱导过程中的卵子染色体加倍操作进行优化的目的。研究结果表明，在固定热休克处理温度为38～39℃，热休克处理持续时间为2min的前提下，20℃、22℃和25℃三种不同预处理水温组的孵化率与正常仔鱼数量曲线都形成一个单一的峰，且均在3．4 τ0时达到最佳优化点，对应胚胎发育阶段为第一次卵裂中期。结果提示了以T0单位度量热休克处理时机的准确性以及该优化方法在鲤科鱼类雌核诱导操作中的通用性，从而为相关鱼类的雌核发育操作提供了有价值的资料。     

人工雌核发育红草金鱼体色的定向发育研究

[目的]探讨人工雌核发育红草金鱼F1代的体色发育方向及其与母本的差异性,为观赏鱼类优质体色的定向培育奠定基础.[方法]采集兴国红鲤和黄锦鲤的精子,经紫外光照射失活后,分别刺激红草金鱼成熟卵细胞,受精卵经冷冻休克、染色体加倍处理后进行人工孵化,即获得雌核发育的二倍体,并以兴国红鲤(♂)、黄锦鲤(♂)与红草金鱼(♀)杂交的二倍体为对照,分别计算其孵化时长和孵化率,统计F1代体色和体形的表型及比例.[结果]以兴国红鲤和黄锦鲤的失活精子诱导红草金鱼雌核发育产生F1代个体,其孵化率分别为8.1％和1.7％,孵化时长分别为92和97 h;且均以红色个体(含桔红色和淡红色)为主,分别占98.6％和99.3％,夹杂有少量青灰色和黄灰色个体.雌核发育F1代红色个体均显母本形态,呈鲫鱼型;青灰色和黄灰色个体则略带父本形态,形体介于鲫鲤之间.根据生长发育过程中鱼体体色发生生理的转变进程,可将红草金鱼雌核发育F1代鱼苗的体色转变进程划分成5个阶段.[结论]异源失活精子诱导红草金鱼雌核发育的F1代个体可定向发育成母本体色,因此应用人工雌核发育技术结合体色选育技术,可定向培育高档观赏鱼类的优质花色.     

金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究

开展了金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究,用紫外线灭活的鲤鱼精子激活金鱼卵子,采用热休克处理卵子使其染色体加倍,获得雌核发育的二倍体金鱼苗。将假受精的金鱼卵放入室温(21±2)℃室内塑料盒里孵化,10 min后卵膜吸水膨胀,60 min后开始卵裂,8 h后出现囊胚期,29 h后出现原肠胚期,39 h后出现神经胚期,56.8 h后器官开始形成,3 d后孵化出小苗,受精率为65.16%;平均孵化率为50.28%;诱导率15.80%,正品率为67.90%。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育早期胚胎发育及其倍性分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎（Crassostrea gigas）精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝（Chlamys farreri）第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用荧光显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察。结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体（DCB）,DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;雌核发育胚胎的发育速度明显滞缓,经6-DMAP处理后胚胎发育速度加快,发育同步化;在雌核发育二倍体诱导过程中,还观察到杂交体、异源三倍体、雌核发育单倍体、雌核发育四倍体。结果为异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育提供了细胞学证据。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育早期胚胎发育及其倍性分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎（Crassostrea gigas）精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝（Chlamys farreri）第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用荧光显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察。结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体（DCB）,DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;雌核发育胚胎的发育速度明显滞缓,经6-DMAP处理后胚胎发育速度加快,发育同步化;在雌核发育二倍体诱导过程中,还观察到杂交体、异源三倍体、雌核发育单倍体、雌核发育四倍体。结果为异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育提供了细胞学证据。     

团头鲂雌核发育后代的微卫星标记分析

采用松浦镜鲤(Cyprinus carpio Songpu carp)的紫外线遗传灭活精子刺激团头鲂(Megalobrama amblycephala)卵子后冷休克抑制卵子第二极体释放方法,获得团头鲂雌核发育个体。流式细胞仪检测雌核发育个体的DNA含量与正常团头鲂二倍体的DNA含量并没有显著性差异,表明雌核发育个体为二倍体。通过引物优化,筛选父母本具有特异性的8对微卫星引物,对雌核发育后代进行检测,结果表明雌核发育个体的遗传物质均来自母本,没有父本的遗传物质渗入。筛选出母本为杂合的10对微卫星引物对子代的纯合性进行评价,结果显示雌核发育后代在TTF-EST46、TTF-EST61、TTF-EST851位点全部为纯合,而TTF-EST12座位上的重组率为86.4%,其他6个位点的重组率为100%,这10个位点的平均重组率为68.64%。试验结果表明,通过抑制第二极体并不能获得纯合性较高的团头鲂雌核发育个体,但具有与母本较高的遗传同质性,可以作为良好的育种材料使用。     

3种硝基芳烃化合物对锦鲤鱼的急性毒性研究

[目的]研究硝基芳烃化合物对锦鲤鱼的急性毒性效应,从而为硝基芳烃化合物的水环境风险评价提供基础数据。[方法]以锦鲤鱼(Cyprinus carpio)为试验生物,将其暴露于不同浓度的对硝基甲苯、邻硝基苯胺和对硝基苯胺3种化合物试验液体中,分别采用改良寇氏法和概率单位法计算半数致死浓度(LC50),并采用u检验法比较两种计算结果的差异。[结果]通过两种计算方法,所得LC50之间无显著差异,均能表示3种化合物对锦鲤鱼的毒性水平。以两种结果的平均值作为最终LC50。对硝基甲苯、邻硝基苯胺和对硝基苯胺96 h LC50分别为41.43、20.42和49.36 mg/L。[结论]对邻硝基苯胺、对硝基甲苯和对硝基苯胺对锦鲤鱼均属于中等毒性物质,其急性毒性依次降低。     

利用Cyt b基因序列研究翘嘴红鲌的系统发生

线粒体细胞色素b基因序列分析可显示种间及种内遗传差异,广泛用于种类鉴定和系统发生研究。为了阐明翘嘴红鲌与其他鳊亚科鱼类的亲缘关系,扩增并测定了翘嘴红鲌的414bp细胞色素b基因片段序列。所获序列与4种鳊亚科鱼类细胞色素b基因的相应序列进行比较,发现共有61个多态性核苷酸位点（14．73％）,大多数位点出现在密码子的第3位且主要为碱基转换。翘嘴红鲌与鳊之间的序列同源性最高,为93．48％,与广东鲂、三角鲂和团头鲂的序列同源性则分别为90．58％,90．82％,91．30％。以鲤为外群,分别利用MP法和NJ法分析上述序列数据,获得相似的系统发生树。该结果显示,翘嘴红鲌和鳊聚为1个支系,广东鲂、三角鲂以及团头鲂则聚为另1个支系,说明翘嘴红鲌与鳊的亲缘关系较近,而与广东鲂、三角鲂及团头鲂的亲缘关系则较远。     

鄱阳湖鲤、鲫鱼资源变迁及其原因初探

[目的]保护和合理开发利用鄱阳湖鲤、鲫鱼资源。[方法]在分析1959-2006年鄱阳湖鲤、鲫鱼资源数据的基础上,分析近50年鄱阳湖鲤、鲫鱼资源变迁情况,并初步探讨了该变化的发生原因及相关应对措施。[结果]50来鄱阳湖鲤、鲫鱼虽成为优势种群,但其个体越来越小,性成熟年龄也越来越小,资源呈现出严重衰退状况。其原因主要是由于鄱阳湖枯水期水位过低,水质污染,加上过度捕捞以及非法渔具渔法的滥用等方面引起的。[结论]应明确鄱阳湖鲤、鲫鱼产卵场的范围,严格控制鄱阳湖流域工业污水、城市污水以及农业面污染源的直接排放。     

鲤鱼急性铜中毒的病理学研究

[目的]为渔业生产和环境水质评价提供科学资料。[方法]通过急性中毒试验,研究铜中毒后鲤鱼的临床症状与剖解变化、病理组织学变化和超微结构变化。[结果]铜对鲤鱼的24、48和96 h半数致死浓度(LC50)分别为1.67、1.25、0.77 mg/L,安全浓度为0.077mg/L。中毒鱼体表和鳃的粘液增多,鳃上附着少量淡蓝色的絮状物,临死前出现神经症状。中毒鱼肝脏主要表现为肝细胞空泡变性和多发性溶解性坏死。鳃小片上皮细胞严重增生,鳃丝肿胀呈棍棒状。增生的上皮细胞变性、坏死、脱落,严重者仅剩下裸露的毛细血管。[结论]铜会损害鲤鱼的多种组织。     

风干武昌鱼中微生物变化及理化性质的分析

[目的]分析风干武昌鱼生产过程中微生物数量和理化指标的变化。[方法]按总茵数、乳酸菌、葡萄球菌和酵母茵几个大类研究其微生物变化情况;理化方面,分析了pH、水分含量、水溶性固形物、水溶性蛋白氮及挥发性盐基氮几项重要指标。[结果]乳酸菌为风干武昌鱼发酵过程中的优势菌群;各种微生物复杂变化的同时导致产品pH和水分含量下降,水溶性固形物和水溶性蛋白氮的含量增加;产品的挥发性盐基氮含量符合国家标准。[结论]该研究为风干武昌鱼的标准化生产体系的建立以及稳定生产奠定了基础。     

团头鲂种质资源及遗传改良研究进展

团头鲂作为中国特有的优良草食性鱼类,现已成为主要淡水水产养殖品种之一。然而多年来的人工繁殖、过度捕捞、环境污染等因素,导致团头鲂种质资源出现混杂并受到衰退的威胁,开展团头鲂种质资源保护和遗传改良研究势在必行。本文总结了团头鲂形态学、细胞遗传学、分子群体遗传学和基因组等种质资源研究方面的成果,并简要概括了杂交育种、选择育种、雌核发育等方法在团头鲂遗传改良方面所取得的进展,以期为团头鲂种业的可持续发展提供基础资料。     

运用RAPD技术鉴别建鲤雌核发育后代的研究

用紫外线灭活红鲫Carassius auratusvar. red精子,诱导建鲤Cyprinus carpiovar. jian进行人工雌核发育,共获得241尾雌核发育子一代鱼。经形态特征初步分类后,取10尾进行RAPD分析,以鉴别雌核发育鱼。用筛选的10种随机引物,均可扩增出建鲤和红鲫的特征条带。扩增结果发现:部分子一代仅出现建鲤特征条带,未发现红鲫特征条带,为雌核发育鱼;部分子一代既有建鲤特征条带,也出现红鲫特征条带,为鲤、鲫杂交鱼。本试验结果表明,采用RAPD技术可高效、准确地鉴别出异源精子诱导的雌核发育鱼。     

滁州鲫雌核发育的细胞学研究

研究产于安徽省滁州市城西水库的滁州鲫是否行雌核发育繁殖.对滁州鲫♀×滁州鲫♂及滁州鲫♀×红鲤♂受精卵进行细胞学研究,结果表明:(1)在刚产出的成熟卵细胞内没有发现极体,在精子入卵约15～16min后(水温为18～20~C),单个极体被排出;(2)在受精卵内,精核保持凝聚状态,没有形成雄性原核;(3)精子入卵20 min后,卵核形成雌性原核,在第一次卵裂前没有观察到雌性原核与呈凝聚状态的精核的融合;(4)同源与异源精子激发滁州鲫卵的发育过程基本相同,异源精子能进入滁州鲫卵细胞并激发卵核形成雌性原核,并进行正常胚胎发育,其鱼苗正常,无畸形和无杂交性状的鱼苗.研究表明,滁州鲫为雌核发育鱼类.     

长丝裂腹鱼MyoD1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆长丝裂腹鱼的MyoD1基因,并对其进行序列分析。[方法]根据鲤鱼(Cyprinus carpio)的MyoD1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对长丝裂腹鱼MyoD1的全长cDNA序列进行扩增,并对该基因编码氨基酸的理化性质及同源性进行预测和分析。[结果]试验获得了包括完整ORF的长丝裂腹鱼MyoD1基因,该序列长957 bp,编码274个氨基酸,具有MRFs家族基因的典型性碱性bHLH结构;该MyoD1序列与齐口裂腹鱼、鲤鱼、斑马鱼和虹鳟等的MyoD1序列同源性较高,与人、猪、牛等哺乳动物的同源性较低。[结论]该研究为长丝裂腹鱼的肌肉发育和肉质特性形成的分子机制研究提供了基础数据,同时为青藏高原冷水鱼资源的利用与保护提供了指导意义。     

黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。