利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

牛生长激素基因工程菌的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍.     

牛生长激素基因工程茵的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素（BST）蛋白，构建了工程菌并进行了诱导表达．先设计2对引物，从pUCm—T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列，双酶切后分别插入表达载体（pET30a和pET29a），转化E．coli DH5a并进行阳性克隆鉴定；再将重组质粒分别转化到E．coli BL21（DE3）和RosettaTM（DE3）pLysS中，构建BST原核工程菌；最后进行诱导表达．结果表明，重组表达载体pET30a—BST和pET29a—BST中均插入了正确的目的基因；经IPTG诱导后，以BL21（DE3）为宿主的工程菌无目的蛋白表达，而pET30a—BST／Rosetta^TM和pET29a．BST／Rosetta^TM分别可见分子量约29．5，26．5kD的融合蛋白表达，约占菌体蛋白的26％，35％．说明稀有密码子限制BST基因在E．coli中的表达。选择适宜的宿主菌可克服此障碍．     

版纳微型猪近交系性别决定基因（SRY）原核表达载体的构建及蛋白高效表达

 为了构建版纳微型猪近交系SRY的原核表达载体pET 32a(+) SRY,并通过诱导使其在大肠杆菌中获得高效表达,研究采用添加限制性内切酶位点的引物特异性扩增SRY,连入pMD19 T simple载体,转化入大肠杆菌DH5α,克隆后提取pMD19 T SRY阳性重组质粒,使用相同的内切酶同时对pMD19 T SRY质粒和原核表达pET 32a（+）载体进行酶切,连接后使SRY定向克隆到pET 32a(+)表达载体中。经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α,提取质粒后再次转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并通过15% SDS PAGE鉴定。结果显示,不同浓度IPTG诱导的SRY均在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达。     

抑制素α-亚基成熟区基因在大肠杆菌中的原核表达

本试验成功获得抑制素α-亚基编码序列的克隆载体后,从阳性细菌中提取质粒,经SacI和XhoI酶切,回收354bp目的片段,与表达载体pET-32a连接,将构建好的pET32a(+)-INH-α原核表达质粒转化到受体菌E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,Tricine-SDS-PAGP电泳鉴定,检测到仔鹅与东北白鹅抑制素-α成熟区基因的表达。     

纳豆激酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

该文采用PCR方法扩增获得了纳豆激酶基因(pro-NK),通过酶切与酶连反应使其与原核表达载体Pet32a相连,构建重组质粒Pet32a-pro-NK,先转入到大肠杆菌DH5α中进行筛选与验证,再将阳性克隆子转化到宿主菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行纳豆激酶蛋白的表达研究。SDS-PAGE电泳分析结果表明,纳豆激酶蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达。     

金黄色葡萄球菌多药耐药基因norA的克隆及其原核表达

按金黄色葡萄球菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增出norA基因中1155bp cDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌JM109中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经Nde Ⅰ和XhoⅠ酶切，回收1155bp目的片段，定向克隆到pET28a（＋）表达载体中，转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒，再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出norA基因的表达。     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

假肠膜明串珠菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

利用PCR的方法从假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides 1159)的DNA中扩增得到D-乳酸脱氢酶基因,构建重组克隆质粒(pMD19-T-DLDH),转化DH5α进行蓝白斑筛选,得到阳性克隆提取质粒双酶切验证。连接pET-32a表达质粒,构建重组表达质粒,提取质粒双酶切、测序验证,测序结果与原序列基本相符。得到重组表达质粒pET-32-DLDH转化BL21大肠杆菌IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有明显大小约为19 ku的特异蛋白条带。     

冰核活性细菌的冰核基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

广泛存在于自然界的冰核活性细菌,是诱发和加重植物霜冻的重要因素。在已查明我国冰核细菌种类、分布、成冰活性、影响成冰活性因素及其诱发植物霜冻机理等研究基础上,又采用分子生物学技术对冰核细菌进行不研究。我们克隆了冰核基因,并使其在大肠杆菌中进行表达。 我们选用丁香假单胞菌强冰核活性菌株IS-24(P.syringae)和黄单胞菌中等活性菌株Xt-4(X.campestrts pv.hordel),株的基因文库,经Sau3A部分消解DNA,回收一定长度范围的片断,插入到BamHI位点,转化大肠杆菌,(转化率为1.8×10~4)。大量筛选阳性克隆,再转板培养以充分表     

冰核细菌的研究方法

 简单回顾了冰核细菌研究的历史,根据我们多年来的研究工作经验,详细介绍了冰核细菌研究的基本方法和简单实用的试验研究经验,包括样品的采集、分离及冰核活性的测定等。     

冰核细菌的定量分离研究

 冰核细菌可能是自然界中诱发和加重霜冻敏感植物发生霜冻害的重要原因之一。由于单个的冰核细菌细胞并不具有冰核活性,因此,研究植物上冰核细菌的种群数量或密度是研究冰核细菌与植物霜冻害关系的关键。从云南省的元江、寻甸、河口、呈贡、临沧、陆良、宣威、曲靖、富民、昆明市官渡区及越南老街等地采集到108种植物共166个标样中,有45个标样分离共到71株冰核细菌,标样中冰核细菌的检出率为27.1％,最低密度为6.0×10⁴ CFU/g,最高密度为5.12×10⁹ CFU/g。其余121个标样经再次分离未检测冰核细菌,占总标样数的72.9％。在云南植物上,用稀释平板法可检测冰核细菌的最低密度为2.0×10⁴ CFU／g.     

冰核细菌的研究、应用现状和前景

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在进行霜冻防治研究方面,取得了一定效果.目前世界上已发现4个属23个种或变种的细菌具有成冰活性.细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达.综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在霜冻防除、人工降雨、食品冷藏保鲜、高敏检测和促冻杀虫等方面的研究进展和应用前景.     

果树抗寒性的研究进展

本文对果树抗寒性的研究鉴定方法,器官组织结构、需寒量与抗寒性的相关性,冰核细菌的研究进展,及在越冬前寒冷驯化中植物细胞的生理变化进行了较系统的综述。以便为果树抗寒性的研究、抗寒品种的选育提供科学的参考。     

果树霜冻害研究进展

介绍了霜冻害对果树的危害、霜冻害的机理和防霜措施的研究情况;还扼要介绍了冰核活性细菌与果树霜冻害的关系及其近年来国内外的研究进展;并就今后果树霜冻害机理和防霜措施的研究重点及方向提出了自己的观点。     

植物抗霜剂减轻蚕豆霜冻害的研究

 从10种供试药剂中筛选出1号、3号、4号、5号、10号等5种抗霜剂,用于防除INA细菌,减轻蚕豆霜冻,效果稳定。在此基础上开发的农大防霜剂5号,防霜效果好,能使蚕豆增产10%～20%,具有良好的应用前景。     

我国生物冰核研究进展

我国从1986年起开展了冰核活性细菌的研究,已取得一定的进展。查明了我国冰核细菌种类、分布规律、冰核活性强弱程度,明确了影响冰核细菌冰核活性的某些因素和提出了菌种保存方法;验证了冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因素,研究揭示冰核细菌、低温强度和植物霜冻害三者的关系,并进行了药剂和生物防霜新技术研究;利用冰核细菌研制成功了冰蛋白降水催化剂,开展了促冻杀虫、克隆了编码冰蛋白的冰核活性基因及有关冰核细菌分子生物学应用技术研究;首次报道了大麦黄矮病毒冰核活性,对揭示未知生物冰核种类有一定意义。     

中国渔业用冰量的分析评估

随着我国渔业生产的发展,渔业用冰需求量逐渐增大,而我国目前尚无官方公布的渔业用冰需求量统计数据,制冰企业无法根据市场需求调节生产规模;制冰企业对用冰消费市场结构和发展趋势不掌握,直接造成制冰企业生产存在盲目性。通过建立经典的线性回归模型,估算出1995—2016年渔业用冰量,并与全国水产冷库制冰量趋势线相拟合,得出两者趋势一致的结论。表明估算得到的结果相对客观准确,符合我国渔业用冰的实际情况。通过异方差检验、平稳性检验、协整检验等一系列计量检验,表明回归模型不存在异方差,变量之间存在稳定及长期均衡关系,因而估算结果具有严格的统计意义。从总体趋势上看,我国的渔业用冰量不断增长,说明我国渔业生产规模正呈现不断扩大的趋势。进一步研究表明:我国涉渔第一产业预估用冰量占比较大,为40.74%,但年均增长率为3.04%;涉渔第二产业预估用冰量在三个产业中占比最小,为12.17%,但年均涨幅最高,达到7.99%;涉渔第三产业预估用冰量占比最高,为47.09%,且年均增长率为4.73%。预计到2030年,渔业总用冰量达到1 927万吨。