饵料种类、配比及投喂方式对单环刺螠幼虫生长和变态的影响

为确定单环刺螠Urechis unicinctus人工苗种繁育中适宜幼虫生长发育的最佳饵料种类、配比及投喂方式,通过测定幼虫生长速率、成活率和变态率,对饵料品种、配比及投喂方式等进行了一系列对比试验研究.结果表明:饵料对单环刺螠幼虫生长和变态具有显著影响(P<0.05);单一饵料品种投喂结果显示,小球藻饵料组与球等鞭金藻饵料组的体节幼虫体长日增长率和幼虫成活率显著高于其他饵料组(P<0.05),但这两组间无显著性差异(P>0.05),小球藻饵料组的幼虫变态率(17.24％±0.89％)显著高于球等鞭金藻饵料组和其他饵料组(P<0.05),这表明小球藻是单一饵料投喂单环刺螠较好的开口饵料;混合饵料投喂结果显示,小球藻+球等鞭金藻+酵母粉混合饵料和小球藻+球等鞭金藻混合饵料组中,体节幼虫的体长日增长率和幼虫成活率显著高于其他混合饵料组(P<0.05),但这两个混合饵料组间无显著性差异(P>0.05),搭配投喂小球藻+球等边金藻+酵母粉混合饵料组的幼虫变态率(21.72％±0.85％)显著高于小球藻+球等鞭金藻混合饵料组和其他混合饵料组(P<0.05),这表明小球藻+球等边金藻+酵母粉的混合饵料组幼虫整体培育效果最佳;进一步的饵料配比及投喂方式研究显示,将小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3种饵料按照2:1:1比例混合,在担轮幼虫前期只投喂小球藻+球等鞭金藻,至担轮幼虫中后期增加投喂酵母粉试验组,获得的幼虫变态率最高(24.73％±0.78％),显著高于其他试验组(P<0.05),且幼虫发育齐整度良好;饵料日投喂量结果显示,初孵担轮幼虫适宜的日投喂量为2×104 cells/mL,随着幼虫发育饵料投喂量逐渐增加,当出现蠕虫状幼虫时日投喂量应增加至10×104～12×104 cells/mL.研究表明,单环刺螠幼虫培育的最佳饵料投喂方案为,将小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3种饵料按照2:1:1比例混合,在担轮幼虫前期只投喂小球藻+球等鞭金藻,至担轮幼虫中后期增加投喂酵母粉.     

不同饵料组合对企鹅珍珠贝幼虫生长发育的影响

采用3种单胞藻和自溶面包酵母组合成8种不同的投喂方式,对两个比较组别的企鹅珍珠贝幼虫的饵料效果进行对比试验,探讨适合企鹅珍珠贝育苗的饵料组合和人工饵料对企鹅珍珠贝的影响。结果表明,小球藻、亚心形扁藻和盐藻3种藻类的混合投喂效果最好;企鹅珍珠贝幼虫前期阶段,对藻类的适口性为盐藻>亚心形扁藻>小球藻,发育成眼点幼虫后,对藻类的适口性为小球藻>亚心形扁藻>盐藻;单独投喂自溶面包酵母的试验组在试验进行10 d后全部死亡;试验前用湛江等鞭金藻投喂的企鹅珍珠贝幼虫在壳长以及匍匐幼虫变态百分率的比较上与试验前用自溶面包酵母投喂的企鹅珍珠贝幼虫没有显著差异,但在附板成活率和出苗成活率上差异显著,前期单一投喂自溶面包酵母会导致贝苗后期的活力下降。     

不同藻类对毛蚶浮游幼虫附着的影响

通过投喂不同的藻类,对毛蚶浮游幼虫附着变态进行研究,表明不同的藻类饵料对于毛蚶幼虫附着有显著的影响。多藻种混合投喂的效果优于单一投喂,其中以扁藻与球等鞭金藻混合投喂效果最佳。     

织锦巴非蛤幼虫对不同种类单胞藻的摄食和消化效果

【目的】明确织锦巴非蛤幼虫在不同发育时期饲喂单胞藻饵料的合适种类,为织锦巴非蛤的苗种规模化人工繁育提供饵料投喂策略及参考依据。【方法】以从广西北海市铁山港区自然海域捕捞的织锦巴非蛤2龄贝为亲本,人工培育D形幼虫,在幼虫培育期间分别投喂小球藻、微绿球藻、杜氏盐藻、亚心形扁藻、湛江等鞭金藻、球等鞭金藻、绿色巴夫藻、牟氏角毛藻和三角褐指藻,显微镜下观察幼虫在不同时期对不同种类单胞藻的摄食情况和消化效果。【结果】织锦巴非蛤初孵幼虫（D形幼虫）大小（壳长×壳高）为（82.49±3.02）μm×（63.98±2.16）μm,于4 dph（孵化后第4 d）发育至壳顶前期（115.89±3.86）μm×（101.62±3.80）μm,13 dph进入变态期（205.61±15.84）μm×（182.61±13.53）μm,于15 dph变态至稚贝（225.63±8.99）μm×（198.65±8.25）μm。织锦巴非蛤幼虫在运动过程中也伴随着摄食,通过纤毛的摆动形成水流,单胞藻则随着水流方向进入幼虫口沟,在口沟纤毛摆动下进入胃内,胃内的单胞藻在微绒毛摆动下快速旋转并消化。织锦巴非蛤幼虫在1 dph时能摄食小球藻、微绿球藻、绿色巴夫藻、湛江等鞭金藻和球等鞭金藻,在4 dph时有少量幼虫开始摄食杜氏盐藻,至10 dph时幼虫开始摄食亚心形扁藻和牟氏角毛藻,整个浮游幼虫期均不摄食三角褐指藻。在9种单胞藻饵料中,小球藻和微绿球藻较其他种类更难消化。【结论】在织锦巴非蛤幼虫培育过程中,幼虫开口饵料宜选择湛江等鞭金藻、球等鞭金藻和绿色巴夫藻,在10 dph时适宜投喂杜氏盐藻,至13 dph时可投喂牟氏角毛藻和亚心形扁藻;在其他易被摄食和消化单胞藻种类充足的情况下,一般不选取小球藻和微绿球藻作为幼虫培育的首选饵料。     

几种生态因子对偏顶蛤浮游幼虫生长和发育的影响

为了解偏顶蛤Modiolus modiolus最适培育条件,采用实验生态学方法研究了海水盐度、 pH和饵料对偏顶蛤浮游幼虫生长和发育的影响。结果表明：3种生态因子对偏顶蛤浮游幼虫的生长发育均有显著影响(P<0·05);幼虫生长发育的适宜盐度为25~35,最适盐度为30,但幼虫对高盐度的耐受力比对低盐度的耐受力强;幼虫生长发育的适宜pH为6~9,最适pH为8;饵料试验中,湛江等鞭金藻Isochrysis zhan：jiangensis、新月菱形藻Nitzschia closterium和牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri Lemmerman 3种饵料混合投喂的效果最好,牟氏角毛藻单独投喂以及牟氏角毛藻与新月菱形藻混合投喂的效果最差,湛江等鞭金藻基本上能够满足偏顶蛤早期浮游幼虫生长发育的营养需求,单一投喂湛江等鞭金藻和新月菱形藻组与投喂含金藻的混合饵料组对幼虫的饲喂效果无显著性差异(P>0·05)。     

北方沿海翡翠贻贝人工育苗技术研究

于2011、2012年,在大连对翡翠贻贝Perna viridis室内人工育苗技术进行了初步研究,成功培育出壳长为4.5～10.0 mm的稚贝6 500万个。比较了不同培育密度(5、10、15、20、30、50个/mL)和饵料种类(小球藻、湛江等鞭金藻和小球藻与湛江等鞭金藻的混合饵料)对翡翠贻贝幼虫生长的影响,并分析了在4种附着基(聚乙烯网片、波纹板、聚乙烯网衣、聚乙烯吊绳)和无附着基条件下的采苗效果。结果表明:随着培养密度的增大,幼虫生长速度下降,存活率减小,变态率降低,变态时间延迟;在室内幼虫培育期间,用小球藻与等鞭金藻的混合饵料比单一饵料的投喂效果理想,单一饵料投喂中等鞭金藻效果较好;在幼虫变态过程中,聚乙烯网片的采苗效果最理想,其次为波纹板,无附着基的采苗效果最差。     

不同饵料对厚壳贻贝稚贝生长、存活及淀粉酶活性的影响

为了解不同饵料对厚壳贻贝Mytilus coruscus稚贝生长、存活及消化能力的影响,在温度为18℃、盐度为30的条件下,使用单一湛江等边金藻、青岛大扁藻及其二者的混合饵料(体积比为1∶1)分别投喂壳长为1.31 mm±0.05 mm的厚壳贻贝稚贝,并检测其21 d内的存活率、壳长、壳高、湿质量、特定生长率和淀粉酶活力变化。结果表明:在不同饵料条件下,稚贝的存活率均大于93%,不同处理组间无显著性差异(P0.05);饲养14 d以上时,各饵料组稚贝的壳长、壳高、特定生长率、湿重和淀粉酶活力均为混合饵料组高于其他饵料组;试验结束时,混合饵料组稚贝的各项生长指标及淀粉酶活力均显著高于两个单一饵料组(P0.05)。     

不同转食饵料对圆口铜鱼幼苗存活及生长的影响

采用丰年虫、水蚯蚓、微囊饲料3种饵料的不同配合策略,对圆口铜鱼(Coreius guichenoti)仔稚鱼投喂60 d,以研究对其存活率和生长率的影响。结果表明,30日龄后投喂水蚯蚓的存活率、全长、体长、体重均高于其他试验组,特定生长率为(4.44±0.30)%/d,显著高于对照组和W15微囊饲料组。15日龄后转投微囊饲料组的全长、体长、体重和特定生长率最低。不同的转食策略对圆口铜鱼仔稚鱼的存活及生长有显著的影响,30日龄后投喂水蚯蚓能有效地提高存活率及生长率。     

培育密度及饵料种类对大竹蛏幼虫生长、存活及变态的影响

在水温为22.0~24.8℃、盐度为31~33、pH为8.10~8.50的条件下,研究了培育密度及饵料种类对大竹蛏Solen grandis幼虫生长、存活及变态的影响。结果表明：不同培育密度（5、10、20、40、80个/mL）下,幼虫的生长速度、存活率随着密度的增大而降低;40、80个/mL试验组幼虫不能发育至匍匐幼虫,即不能完成变态;5、10、20个/mL试验组幼虫的变态率随着密度的增大而减小,各阶段幼虫的发育时间随着培育密度的增大而延长。不同的饵料种类及投喂方式,即单独投喂（小球藻、塔胞藻、新月菱形藻、金藻、海洋红酵母）与混合投喂（金藻＋塔胞藻＋新月菱形藻）对幼虫的生长速度、存活率、变态率及幼虫各阶段发育时间的影响也不同,前期单独投喂金藻效果较好,以后混合投喂效果比较理想。研究结果表明,在大竹蛏苗种生产过程中,培育密度为10个/mL左右较为合理,且混合投喂比单独投喂效果更好。     

不同微藻对缢蛏稚贝摄食和生长的影响

用实验生态学方法研究了小球藻(Chlorella sp.)、绿色巴夫藻(Pavlova viridis)、小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、微绿球藻(Nannochloropsis oculata)和湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)对缢蛏稚贝摄食和生长的影响.结果表明:缢蛏稚贝对6种微藻的清滤率随浓度的增加而增大,当达到一定浓度时清滤率反而下降;在相同浓度下,稚贝对中规格的绿色巴夫藻、小新月菱形藻和湛江等鞭金藻的清滤率显著高于小规格的小球藻、微绿球藻和大规格的亚心形扁藻(P<0.05).不同微藻对缢蛏稚贝的存活率顺序为微绿球藻<小球藻+亚心形扁藻+微绿球藻<小球藻<湛江等鞭金藻<亚心形扁藻<小新月菱形藻<绿色巴夫藻+小新月菱形藻+湛江等边金藻<绿色巴夫藻.初始壳长无显著性差异的稚贝经30 d的生长试验,8个饵料组稚贝的壳长出现明显差异(P<0.05);亚心形扁藻组的日生长率均明显高于其他组(P<0.05),壳长增长率和绿色巴夫藻组无显著性差异(P<0.05).从本试验可知,小球藻、绿色巴夫藻、小新月菱形藻、亚心形扁藻、微绿球藻和湛江等鞭金藻的适宜投喂浓度为30×104、15×104、10×104、6×104、40×104和10×104cell/mL,绿色巴夫藻和亚心形扁藻对缢蛏稚贝的生长效果要好于其他微藻.     

几株共同发酵水产下脚料菌株的筛选及鉴定

目前水产下脚料不能得到合理利用,被大量废弃。本研究筛选几株能高效发酵水产下脚料的菌株,分解下脚料产生游离态氮、磷、钾等植物所需营养素。从市售微生物肥料、土壤、腐败鱼体中的微生物分离出44株菌,分别进行单一发酵水产下脚料实验、解磷解钾固氮实验、协同拮抗实验以确定能较好共同发酵水产下脚料的菌株;并通过建立聚类树,结合菌株形态学、生理生化特点,推断菌株的生物属性。最终筛选得到的4株菌分别为,GP2食酸菌、GS4假单胞菌、ZP1黑曲霉和ZP3酵母菌。筛选确定的4株菌,具有较好的发酵水产下脚料产生氮、磷、钾等植物所需营养素的能力,且4株菌作用的发酵液中氮、磷、有机质含量均超过国家微生物肥料标准,这4株菌可以用于水产下脚料发酵。     

大豆GmWRKY148的克隆与功能分析

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体p Bin GFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入p Bin GFP2空载体(EV)的阴性对照发状根。对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61。系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。     

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

小麦残茬对连作西瓜生长及根际土壤微生物的影响

 【目的】土壤微生物群落结构构成是土壤生态环境质量的重要组成部分,探讨两种小麦残茬对连作西瓜生长及根际土壤微生物的影响,阐释西瓜枯萎病与根际土壤微生物间的关系,为西瓜连作障碍和枯萎病的生态防治提供依据。【方法】将D123和D125两种小麦残茬粉碎后施入瓜类连作土壤中并继续栽培西瓜,采用常规方法测定西瓜蔓长、鲜重及产量,稀释平板法测定根际土壤中细菌、真菌和尖孢镰刀菌数量,通过Real-time PCR测定西瓜根际土壤中功能微生物芽孢杆菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌数量。【结果】D123和D125两种小麦残茬的施入,促进了西瓜蔓长的伸长,并在后期显著促进了植株地上鲜重、根鲜重和全株鲜重的增加（P＜0.05）,且D125处理略高于D123处理;残茬处理虽然增加了西瓜单株产量,但与对照（CK）差异不显著。对根际土壤微生物数量统计表明,定植第20天时,D125处理细菌数量显著高于D123处理与CK（P＜0.05）,D123与CK间差异不显著;定植第30天时,D125处理细菌数量显著高于CK（P＜0.05）,D123与CK、D125间差异均不显著。对真菌数量的研究表明,各时期均表现为D125＞D123＞CK,并在定植30 d时相互间差异显著（P＜0.05）。对根际尖孢镰刀菌数量的研究表明,各时期均表现为D125＞D123＞CK,在定植30 d时,D125处理显著高于D123处理和CK（P＜0.05）,但D123处理和CK间差异不显著。土壤中细菌/真菌的比值随着取样时期的延长,呈下降趋势,细菌繁殖速度低于真菌繁殖速度;定植20 d时,D125处理的根际土壤中细菌/真菌的值显著高于D123处理和CK（P＜0.05）,D123处理与CK间差异不显著。随着西瓜植株的生长,土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌的数量呈增长趋势,各时期尖孢镰刀菌均表现为CK＞D123＞D125,在定植第20天和第40天时表现为小麦残茬处理显著降低了尖孢镰刀菌数量（P＜0.05）。芽孢杆菌数据表明,各处理在定植30 d时芽孢杆菌数量均达到最高,其他时期均较低,小麦残茬的施入增加了根际土壤中芽孢杆菌数量,D125处理在各时期均表现为显著高于CK（P＜0.05）,D123处理在定植后20 d和30 d表现为显著高于对照（P＜0.05）,而D125处理在定植后20 d和40 d显著高于D123处理（P＜0.05）,定植后30 d时则表现为相反的结果。【结论】小麦残茬的施入,促进了西瓜生长,有利于土壤微生物繁殖,并增加有益微生物数量,减少枯萎病致病菌数量,对西瓜连作土壤有一定的修复作用。     

大豆和烟草上大豆孢囊线虫田间侵染特征比较分析

【目的】测定和分析2013年同一生长季大豆和烟草上大豆孢囊线虫（Heterodera glycines,SCN）的群体动态和世代发生特点,探讨2种作物对大豆孢囊线虫的寄主适合性差异和温湿度等气象条件对线虫发生的可能影响。【方法】采取“Zig-Zag”取样法对同一地点2种作物上的大豆孢囊线虫每隔6-8 d同时取样,用淘洗-过筛法和贝曼漏斗法分离土壤中线虫,用次氯酸钠-酸性品红染色法对根组织中线虫染色,镜检并计数。统计作物生长季每旬100 g土壤和10 g根组织中各虫态的数量,即群体密度。【结果】在大豆和烟草土壤中,大豆孢囊线虫2龄幼虫均出现于4月7日至9月15日,最大群体密度均发生在7月下旬,之前分别有2个和1个不明显发生高峰;白色雌虫最早均于6月3日出现,其群体密度在大豆土壤中于7月中旬和8月中旬有2个明显的发生高峰,而在烟草土壤中仅于6月份有1个较低水平的高峰阶段;孢囊群体密度均于7月中旬达到最大,之后在大豆土壤中一直保持较高水平,而在烟草土壤中逐渐下降到极低水平。在大豆和烟草根组织中,2龄幼虫最早均出现在5月19日,其群体密度在大豆根组织中出现3个明显高峰,分别发生在5月下旬、6月下旬和7月中旬,而在烟草根组织中出现2个高峰,分别发生在5月中旬和6月下旬,前一高峰不明显;3-4龄幼虫最早分别出现在5月26日和5月19日,最大群体密度均发生在6月下旬,但在5月下旬和7月中下旬在大豆根组织中另有2个较不明显的发生高峰;年轻雌虫最早均于5月26日出现在根组织中。该生长季大豆孢囊线虫在大豆和烟草上的繁殖系数（Rf=Pf/Pi）分别为5.0和0.5。7月上旬之后,大豆孢囊线虫在大豆上继续发生侵入和根内发育,而在烟草上再无侵入,却有许多半埋生根内的空瘪小的褐色孢囊产生。【结论】在同一生长季,大豆孢囊线虫在大豆上发生3代,而在烟草上只发生2代;大豆孢囊线虫在大豆上的繁殖明显较好,大豆寄主适合性程度明显高于烟草。7月份烟草土壤中2龄幼虫不能侵入根系可能与持续过高的土壤湿度有关,而7、8月的高温似乎抑制大豆孢囊线虫在大豆上的世代进程。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

外源柠檬酸对石灰性黄壤养分活化及刺梨实生苗养分吸收与生长的影响

【目的】解析外源柠檬酸活化石灰性黄壤养分的作用,探究外源柠檬酸促进石灰性黄壤上的刺梨实生苗对养分吸收及生长的影响,为贵州喀斯特石灰性黄壤地区刺梨栽培的养分调控提供科学依据。【方法】以石灰性黄壤和‘贵农5号’刺梨实生苗为材料,采用盆栽法,设置每kg石灰性黄壤（干土）施入柠檬酸40、80和120 mg 3个处理,探究外源柠檬酸的不同施用量对石灰性黄壤养分的活化和促进刺梨实生苗养分吸收及生长的作用。【结果】外源柠檬酸施入石灰性黄壤后,土壤pH明显降低,有效氮、磷、钾、钙、铁、锌、硼的含量明显增加,其中80 mg·kg^-1柠檬酸处理的有效磷、钾、钙和硼含量增加得最多。120 mg·kg^-1柠檬酸处理的土壤有效氮、铁、锌含量提高的百分率最大,而有效锰、铜的含量明显降低,对土壤交换性镁的含量无明显作用。土壤中的细菌总数和解磷菌及解钾菌的数量随柠檬酸施用量的增大而增多,真菌和放线菌数量随之减少,其中,以80 mg·kg^-1柠檬酸处理的解磷菌和解钾菌的数量为最多。刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土施入外源柠檬酸后,明显增强了多种土壤酶的活性,随柠檬酸施入量的增加,土壤的脲酶、硝酸还原酶和铁还原酶的活性随之增强,淀粉酶活性随之降低,80 mg·kg^-1柠檬酸处理的土壤碱性磷酸酶、蛋白酶和蔗糖酶的活性最高。外源柠檬酸施入石灰性黄壤后,土壤中柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸的含量明显增加,其中80 mg·kg^-1柠檬酸处理的酒石酸、苹果酸含量和有机酸总量最高,3个处理的草酸含量都明显低于对照。外源柠檬酸施入石灰性黄壤后,刺梨实生苗对N、P、K、Ca、Mg、Fe、Zn、B元素的吸收量明显增加,其中,80 mg·kg^-1柠檬酸处理的刺梨实生苗对上述元素的吸收量最大。刺梨实生苗对Cu的吸收量随柠檬酸施入量的增加无明显改变。外源柠檬酸的施入明显降低了刺梨实生苗根系中柠檬酸和草酸的含量,增加了根系中苹果酸、酒石酸、乙酸和琥珀酸的含量,根系活力和硝酸还原酶、碱性磷酸酶、分泌性碱性磷酸酶、铁还原酶和谷氨酰胺合成酶的活性明显增强,与对照的差异均达到显著水平（P,其中80 mg＜0.05）·kg^-1处理的根系活力、碱性磷酸酶、谷氨酰胺合成酶和根系分泌性碱性磷酸酶的活性最强,硝酸还原酶和铁还原酶的活性随柠檬酸施入量的增加而增强。在施入柠檬酸的石灰性黄壤上,刺梨实生苗的生长、根系发育和根系形态明显改善,其中,80 mg·kg^-1柠檬酸处理的植株生物量、高度、基径、根冠比值、根系总表面积、总体积、总根尖数都最大,3个处理的上述指标均明显大于对照,其差异达到显著水平（P＜0.05）。【结论】外源柠檬酸施入pH＞8的石灰性黄壤后,具有改善土壤生态环境和活化土壤养分的作用,增强多种土壤酶活性,增加土壤中酒石酸、柠檬酸、苹果酸和乙酸的含量,增加细菌总数、解磷菌及解钾菌的数量,促进刺梨实生苗生长。     

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ~(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。     

葡萄果实MYBA1与UFGT、DFR的作用机制

【目的】MYBA1转录因子在花色苷生物合成中扮演着重要角色,通过对葡萄果实发育过程中VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR的表达和花色苷的积累模式以及VvMYBA1与VvUFGT、VvDFR作用机制的分析,阐明花色苷合成调控机制。【方法】利用实时荧光PCR检测VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中的表达模式;采用分光光度计测定葡萄中花色苷积累量的变化规律;用SAS8.0软件分析VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR不同时期表达量及花色苷积累量之间的相关性;通过酵母杂交系统检测VvMYBA1转录激活活性及其与VvUFGT、VvDFR间的作用。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中呈现先上升后下降的趋势,在转色期（花后60-80 d）达到最大值。葡萄果实发育过程中花色苷积累量表现为先上升后趋于稳定,转色期（花后80 d）达到最大值。相关性分析结果表明,VvMYBA1表达量与VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,花色苷积累量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关。酵母杂交系统检测表明,VvMYBA1具有转录激活功能,能够特异结合VvUFGT、VvDFR启动子,与VvUFGT、VvDFR编码的蛋白不具有相互作用。【结论】花色苷含量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,VvMYBA1具有转录激活功能且能特异性结合VvUFGT、VvDFR的启动子,表明VvMYBA1通过激活VvUFGT、VvDFR的启动子来调节其表达,从而调控花色苷的合成积累。     

短小芽孢杆菌AR03挥发性有机物的抑菌活性及其组分分析

【目的】对分离自烟草根际土壤中的一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)AR03菌株产生的挥发性有机物进行抑菌活性测定和组分分析。【方法】采用培养皿对扣熏蒸法和凹玻片孢子萌发法测定挥发性有机物对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)和赤星病菌(Alternaria alternata)菌落、菌丝生长以及孢子萌发的影响,采用离体叶片接种法测定挥发性有机物对烟草黑胫病和赤星病的防治效果;采用顶空加热法收集抑菌挥发性有机物,对其进行气相色谱-质谱(GC-MS)检测,并结合保留指数(retention index,RI)和内标(internal standard,IS)1-十五烯对其组分进行定性和定量分析。【结果】短小芽孢杆菌AR03菌株分泌的挥发性有机物对供试的两种病原真菌均具有一定的抑制作用,表现为经处理后的烟草黑胫病菌菌丝生长稀疏缓慢变粗、分支增多且扭曲、断裂;赤星病菌菌丝生长畸形,其上不产生分生孢子梗,内含物大部分聚集成团导致菌丝干瘪、缢缩。对峙培养2、4、6和8 d时,挥发物对黑胫病菌和赤星病菌菌丝生长的抑制率分别为56.21%和59.23%、64.75%和59.86%、66.13%和61.10%、67.04%和70.00%;对黑胫病菌游动孢子和赤星病菌分生孢子的抑制作用表现为延迟萌发且萌发后的芽管生长缓慢;黑胫病菌产生孢子囊数明显减少,赤星病菌分生孢子各分隔处的细胞畸形肿胀成泡状。离体叶片抗病测定结果显示,挥发性有机物抑制黑胫病菌和赤星病菌病斑在叶片的扩展,对峙熏蒸40 h时,对照叶片黑胫病的发病率为92.50%,圆形坏死病斑直径是25.10 mm,经挥发物处理后叶片发病率为70.83%,病斑直径为9.45 mm,对黑胫病斑扩散的抑制率为62.35%;对峙熏蒸80 h时,对照叶片赤星病的发病率为88.33%,病斑扩散为近圆形的褐色坏死斑,平均直径为8.32 mm,经挥发物处理后赤星病的发病率为60.80%,病斑扩展较慢,平均直径为2.85 mm,挥发物对赤星病斑扩散的抑制率为65.75%。SPME GC-MS分析表明,AR03菌株胞外分泌7种组分挥发性物质,均为C15H24结构的倍半萜烯类化合物,分别是二氢姜黄烯、(E)-β-金合欢烯、γ-姜黄烯、α-姜烯、π-红没药烯、β-倍半萜水芹烯和γ-E-红没药烯;AR03培养1 d后,其中β-倍半萜水芹烯相对含量最高,为80.64%,其次为(E)-β-金合欢烯和α-姜烯,相对含量分别为7.20%和6.67%;随着AR03培养时间的延长,各组分种类相同,但相对含量差异较大,除二氢姜黄烯含量保持基本不变外,其他组分含量呈递减趋势,培养至第6天时,各组分含量下降超过50%。【结论】短小芽孢杆菌AR03菌株能够产生具有较强抑菌活性的挥发性有机物,有潜力作为开发抗真菌代谢物和新药物的重要微生物资源。