IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞增殖和细胞周期的影响

研究添加不同浓度的外源胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖的影响。试验分为对照组和试验组,对照组仅添加与试验组等体积的完全培养基,试验组添加分别含25、50、75μg/mL IGF-Ⅰ的完全培养基,采用细胞计数试剂盒与流式细胞仪检测细胞在0、12、24、48、72 h时IGF-Ⅰ对细胞增殖和细胞周期的影响。结果表明,添加25μg/mL IGF-Ⅰ,培养12 h细胞增殖极显著高于对照组及其他试验组(P0.01)。细胞培养12 h后,对照组细胞增殖显著高于试验组(P0.05)。培养12 h添加IGF-Ⅰ缩短了细胞周期(P0.01)。说明IGF-Ⅰ对细胞增殖具有一定的促进作用,可以缩短细胞周期。在培养基中添加25μg/mL IGF-Ⅰ,培养12 h,对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用最佳。     

利用地塞米松构建建鲤肝切片脂变模型

用地塞米松构建建鲤肝切片脂变模型,并探索最佳建模浓度,初步探究地塞米松致建鲤肝脏脂变的作用机理。建鲤活体取肝,用振荡切片机制备厚度为300μm的建鲤肝切片,27℃培养箱中预培养2 h。将试验分为试验组和空白对照组,试验组用含浓度为0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L地塞米松的L-15培养基于27℃培养箱中培养12 h,空白对照组用L-15培养基培养相同时间,培养结束后,收集试验组和空白对照组中上清液和肝切片。参照试剂盒说明检测上清液中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性,肝切片匀浆中三磷酸腺(ATP)、总蛋白(TP)含量,甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)含量以及脂肪酸合成酶(FAS)活性。结果显示,建鲤肝切片经地塞米松诱导后,ATP含量变化不大;当地塞米松浓度为3.93 mg/L时,试验组的其他指标与空白对照组差异极显著(P0.01)。由此说明,用浓度为3.93 mg/L地塞米松诱导建鲤肝切片12 h可以成功构建建鲤肝切片脂变模型。     

TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及HSP70蛋白表达的影响

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt 技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10 ng•ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10 ng•ml-1 TGF-β1组与对照组差异显著（P＜0.05）;10 ng•ml-1 TGF-β1作用于乳腺上皮细胞, 随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24 h与对照组相比差异极显著（P＜0.01）;LDH活力随作用时间延长而升高,12、24 h与对照组差异极显著（P＜0.01）;DNA完整性随 TGF-β1作用时间的延长发生不同程度降解;TGF-β1作用2～6 h细胞大量表达HSP70,6 h达到高峰,而后下降,2～12 h的表达量均极显著高于对照组（P＜0.01）。【结论】TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,具有浓度依赖性。10 ng•ml-1 TGF-β1可以显著增加细胞凋亡率,提高细胞培养液中LDH活力,使细胞DNA发生不同程度的降解,同时HSP70蛋白随TGF-β1作用时间发生显著的表达变化。本试验结果表明,TGF-β1可以以促进上皮细胞凋亡的方式,促进奶牛乳腺发生退化。     

免疫程序对猪伪狂犬病毒抗体效价的影响

将22头35日龄健康长白仔猪分为试验组和空白对照组,试验组20头,空白对照组2头。按免疫时间和免疫剂量设计不同的免疫程序并免疫试验组仔猪。采集免疫前和首次免疫1个月后试验仔猪前腔静脉血液制备血清,采用猪伪狂犬病胶乳凝集试剂盒检测各试验猪猪伪狂犬病毒抗体效价,比较不同免疫程序对猪伪狂犬病毒抗体效价的影响。结果表明,试验仔猪免疫前后猪伪狂犬病毒抗体效价差异极显著(P0.01),免疫后伪狂犬病毒抗体效价在试验仔猪各个体间差异极显著(P0.01);免疫剂量组A1与A2、A3差异显著(P0.05);免疫时间组B1与B2、B3差异显著(P0.05);采用非配对双样本均值分析,试验组与空白对照组的抗体效价差异极显著(P0.01)。     

苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0(A组),25(B组),50(C组),75(D组)和100μg/mL(E组)苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BMECs活性,采用流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测苦参碱对BMECs凋亡的影响,并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响,采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量进行检测。【结果】用药5d时,低质量浓度(25和50μg/mL)苦参碱对BMECs增殖具有促进作用,高质量浓度(75和100μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有抑制作用;B~E组BMECs的凋亡率均极显著高于A组(P0.01);B~E组BMECs培养上清液中NO和乳酸脱氢酶(LDH)水平明显高于A组。B~E组BMECs的过氧化氢酶(CAT)活性均比A组高,其中C组极显著高于A组(P0.01);B~E组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均极显著高于A组(P0.01),E组的超氧化物歧化酶(SOD)水平极显著高于A组(P0.01),各组MDA含量无显著性差异。与A组相比,苦参碱上调了B~E组BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量。【结论】低质量浓度苦参碱能够促进BMECs增殖,高质量浓度苦参碱则会抑制BMECs增殖;不同质量浓度苦参碱均可提高BMECs的抗氧化能力,其中50μg/mL苦参碱提高BMECs抗氧化能力的效果最明显。     

松针多糖对鸡巨噬细胞HD11的天然免疫调节

【目的】探讨松针多糖对鸡巨噬细胞HD11的天然免疫功能的影响,以期为松针多糖在肉鸡疾病防治方面应用提供科学依据。【方法】试验采用不同浓度的的松针多糖作用于巨噬细胞HD11,试验分为空白对照组、阳性对照组(终浓度为1μg·mL~(-1)的LPS)和松针多糖组(终浓度分别为25、50、100、200、400μg·mL~(-1)的松针多糖)。噻唑蓝(MTT)检测巨噬细胞HD11细胞活性、Griess法检测巨噬细胞HD11细胞上清液中一氧化氮(NO)分泌量、中性红吞噬试验检测巨噬细胞HD11吞噬活性,酶联免疫(ELISA)检测巨噬细胞HD11细胞上清液中干扰素-α(IFN-α)、一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-10(IL~(-1)0)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,荧光定量PCR技术检测HD11细胞中iNOS mRNA表达。【结果】MTT试验结果表明:与空白对照组相比,不同浓度的松针多糖(25、50、100、200、400μg·mL~(-1))对细胞活性没有影响,说明在25-400μg·mL~(-1)范围内对巨噬细胞没有毒性,可以进行免疫调节作用实验。免疫调节作用试验结果表明:与空白对照组相比,不同浓度的松针多糖极显著(P0.01)增加了NO释放量和细胞吞噬活性,极显著(P0.01)或显著(P0.05)提高了细胞因子IFN-α的含量和iNOS的含量及mRNA的表达量,极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低了细胞因子IL~(-1)0的分泌量。当松针多糖浓度在50、100、200、400μg·mL~(-1)浓度时,细胞因子IL-6和TNF-α的含量极显著(P0.01)高于空白对照组。与阳性对照组相比,不同浓度的松针多糖极显著(P0.01)降低NO释放量,极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低了细胞因子IFN-α的含量、iNOS的含量及mRNA表达量和IL~(-1)0含量。当松针多糖浓度在25、50、100μg·mL~(-1)浓度时,细胞吞噬活性极显著(P0.01)低于阳性对照组,细胞因子IL-6的含量极显著(P0.01)低于阳性对照组。当松针多糖浓度在25、50、100、200μg·mL~(-1)浓度时,细胞因子TFN-α的含量极显著(P0.01)低于阳性对照组。【结论】松针多糖能显著提高巨噬细胞HD11的天然免疫调节能力,且存在剂量依赖效应。     

两种病原菌联合诱导大鼠实验性乳腺炎研究

为深入研究奶牛乳腺炎提供一个更方便、经济的实验平台,试验建立了由金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合诱导的大鼠乳腺炎模型。分别用低浓度(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌浓度均为1×105mL-1,L组)和高浓度(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌浓度均为1×1012mL-1,H组)细菌混合液,经乳头管灌注到大鼠第4对乳腺内,诱导大鼠的乳腺炎试验。结果表明,低浓度组(L组)乳腺的病变主要以腺泡上皮发生轻度脂肪变性,腺泡腔的分泌物中有透明滴状物为主要特征,高浓度组(H组)的乳腺腺泡结构破坏严重,腺泡中有较多的嗜中性粒白细胞浸润。L组乳腺组织IL-6水平较对照组有所升高,H组则有显著(P<0.05)下降,试验组血清IL-6水平均极显著(P<0.01)低于对照组;L组和H组乳腺组织TNF-α水平分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于对照组,血清TNF-α水平均极显著(P<0.01)低于对照组。试验组乳腺NAGase活性均显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于对照组;试验组血清NAGase活性均低于对照组,其中H组极显著(P<0.01)下降。由上述结果可知,高低浓度的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合诱导的大鼠乳腺炎模型均已成功建立。     

三聚氰胺及其与三聚氰酸联合攻毒对Vero细胞的毒害作用研究

为补充三聚氰胺的毒理学资料,以易于生长的传代细胞为研究对象,采用形态学观察、MTT法、中性红法等,检测三聚氰胺及其与三聚氰酸混合物对体外培养的Vero细胞的影响。结果表明:不同浓度三聚氰胺及其与三聚氰胺混合物对Vero细胞均会产生一定影响:圆缩细胞增多,贴壁细胞数量减少,且呈现出一定的浓度依赖性。混合组还表现出不规则细胞形态增多。三聚氰胺浓度超过0.75mg·mL-1时会极显著抑制细胞的增殖(p0.01),细胞毒性级为1级;而二者混合攻毒时毒性明显增强,浓度超过0.094mg·mL-1时会显著或极显著抑制细胞的增殖(p0.05或p0.01),细胞毒性级为2级。同时,该类化合物对蛋白质的合成没有明显的影响,但三聚氰胺及其混合物,均会干扰Vero细胞对中性红的摄取率,由此推测该类化合物对细胞的溶酶体可能会产生一定的损伤。三聚氰胺及其混合物对Vero细胞均会产生一定毒性。     

人参皂苷促进小鼠成骨细胞增殖的作用及机制

目的 观察人参皂苷（Ginsenoside,GSS）对小鼠成骨细胞增殖活性的影响,并探讨其作用机制。方法 采用MC3T3-E1小鼠成骨细胞系, 加入不同浓度的GSS （3.125~50 μg/mL） 培养后,MTT法检测GSS对成骨细胞增殖的影响,荧光定量RT-PCR法检测不同浓度各组细胞内p21和p27 mRNA的表达水平,并采用Western-blot检测细胞周期相关蛋白表达。结果 与空白对照组相比,3.125~50 μg/mL的GSS在24、48 h时均能够显著促进成骨细胞的增殖(P<0.01或0.05),其作用具有时间依赖性和浓度依赖性。50、25 μg/mL的GSS能够显著抑制p21和p27的mRNA表达(P<0.01),而12.5 μg/mL的GSS对其表达无影响。50、25 μg/mL的GSS抑制了细胞周期抑制蛋白p21及p27表达水平并上调Cyclin D1表达(P<0.01或0.05)。结论 GSS能够通过上调Cyclin D1表达,抑制p21和p27表达,进而促进小鼠成骨细胞增殖.     

巯氧吡啶钠抗人癌细胞及胚胎组织细胞作用的体外试验

体外培养试验表明巯氧吡啶钠在0.01～1μg/ml浓度下对人低分化鼻咽癌上皮细胞、伯基特淋巴瘤细胞、人胚肺细胞,人胚肾细胞,宫颈癌细胞都有显著的抑制作用,接触后12小时可见细胞大量脱落死亡,生长曲线明显下降。药物作用主要表现浓度依赖性,但也表现时间依赖性。     

镉损伤肝细胞体外模型的建立

在建立大鼠原代肝细胞体外培养的基础上,研究了不同浓度的醋酸镉对肝细胞存活率的影响。在原代肝细胞体外培养的不同时间点(4、7、10、24 h),用不同浓度的醋酸镉(0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)处理3 h,MTT法测定细胞的相对存活率。结果显示,随着镉剂量的增加,细胞的相对存活率降低。当醋酸镉浓度为4.0μmol/L,细胞的相对存活率为78.35%,与对照组有极显著性差异(P0.01);用4.0μmol/L醋酸镉在不同时间点处理肝细胞,与对照组相比,细胞存活率均极显著降低(P0.01)。表明镉损害肝细胞具有一定的浓度依赖性。     

辛伐他汀通过激活p38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖的研究

为研究辛伐他汀通过激活p38MAPK信号通路对小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖的影响,将试验分为2个部分:①将辛伐他汀作用于MC3T3-E1细胞,设置不同的辛伐他汀浓度和作用时间,采用pNPP、CCK8方法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性并得到辛伐他汀对MC3T3-E1细胞增殖作用的最适浓度和最佳培养时间.②设3个试验组,即空白对照组、辛伐他汀组、辛伐他汀+p38抑制剂组,在辛伐他汀最适浓度和最佳培养时间的条件下,采用CCK8、pNPP、ELISA、Western blot方法检测各组细胞活力、碱性磷酸酶活性、分泌Ⅰ型胶原蛋白(COL-I)含量以及p-p38表达水平.结果表明:与空白对照组相比,当辛伐他汀浓度为10-5 mol·L-1、培养时间为36 h时,MC3T3-E1细胞的增殖作用较为明显;空白对照组与辛伐他汀组相比,后者ALP活性和p-p38蛋白表达水平明显增高,Ⅰ型胶原蛋白分泌增多;辛伐他汀组与辛伐他汀+p38抑制剂组相比,后者ALP活性和p-p38蛋白表达水平明显降低,Ⅰ型胶原蛋白分泌减少.综合而言,辛伐他汀可通过激活p38MAPK信号通路促进MC3T3-E1的增殖,提高ALP活性和增加COL-I分泌.     

小槐花提取物对甲型H1N1流感病毒感染的体外抑制作用

采用CCK8法测定小槐花提取物在MDCK细胞上的最大安全浓度（Maximum no-cytotoxic concentration, MNTC）;建立甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1, PR8)感染MDCK细胞模型,CCK8法检测其对病毒感染细胞病变的抑制作用;利用荧光定量PCR及免疫印迹方法,检测小槐花提取物对流感病毒基因、蛋白,以及宿主炎症相关转录因子和炎性细胞因子表达的影响。细胞毒性试验结果显示,小槐花提取物对MDCK细胞的MNTC为100 mg/L;qRT-PCR结果显示,小槐花提取物能显著抑制PR8流感病毒M与NP基因的mRNA表达（P<0.01）,也可显著下调病毒感染细胞的转录因子NF-κB p65、STAT3及炎性细胞因子IL-1β、TNF-α基因的表达水平,且其抑制作用与药物浓度正相关;免疫印迹法检测显示,100 mg/L的小槐花提取物极显著抑制了流感病毒M1蛋白的表达（P<0.01）。小槐花提取物具有较显著的体外抗流感病毒效果,此研究结果为从小槐花中鉴定具有抗流感病毒的确切药效成分奠定基础。     

香烟烟雾水溶液诱导大蒜根尖细胞产生微核

为了探究香烟烟雾水溶液对大蒜根尖细胞遗传物质的影响,通过常规的微核技术观察了香烟烟雾水溶液不同浓度和不同时间处理下根尖细胞中微核的形态和数量。结果表明:在0.5~8支/m L的浓度范围内,大蒜根尖细胞的微核率随着浓度的增加而不断上升,差异极显著(P0.01);在12~36 h处理时间范围内,微核率随着处理时间的增长呈现先升高后降低的趋势;当处理时间为12和24 h时,微核率随着浓度的增加而明显上升,而当处理时间为36 h时,微核率随着浓度的增加呈现先升后降的趋势;香烟烟雾水溶液的浓度和处理时间与微核的产生显著正相关,烟雾浓度对大蒜根尖细胞微核产生的贡献更大;试验组的细胞微核率均极显著高于空白对照组(P0.01),微核指数均大于3.5,属于重度损伤。上述结果表明,香烟烟雾水溶液在较低的浓度(0.5支/m L)和较少的处理时间(12 h)就对植物遗传物质产生严重损伤。     

增瘦剂对长×巴猪(F_1)染色体诱变的研究

本文采用外局血淋巴细胞培养及姊妹染色体分染技术,对埋植增瘦剂的长×巴猪(F_1)染色体进行了研究,结果表明,在所统计的细胞中,试验组正常二倍体细胞(2n=3.8)的百分率为71.43％,对照组为80.36％,差异极显著(P<0.01);试验组多倍体细胞数(8.33％)极显著地高于对照组(2.23％,P<0.01);试验组染色体断裂细胞百分率(10.67％)与对照组(8.00％)之间差异不显著(P>0.05);试验组姊妹染色体交换频率(1.88)极显著地高于对照组(0.76,P<0.01)。     

咯利普兰对猪中性粒细胞表达Mac-1的作用及有关信号机制

【目的】阐明咯利普兰为代表的磷酸二酯酶4抑制剂的抗炎新机制。【方法】采用密度梯度离心法分离猪中性粒细胞,流式细胞术检测猪中性粒细胞表达巨噬细胞表面分子抗原-1(Macrophage surface molecular antigen-1,Mac-1);Real-time qPCR和Western blot技术检测猪中性粒细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p65核转录因子(p65 NF-κB)mRNA表达和磷酸化活性。【结果】佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)可显著上调中性粒细胞表达Mac-1(P<0.01),咯利普兰对PMA上调的中性粒细胞表达Mac-1有一定抑制作用,其中,5μmol/L咯利普兰可极显著抑制中性粒细胞表达Mac-1(P<0.01);PMA可极显著上调中性粒细胞p38 MAPK、ERK和p65 NF-κB mRNA表达和磷酸化活性(P<0.01),5μmol/L咯利普兰对PMA升高的中性粒细胞p38 MAPK、p65 NF-κB mRNA表达有极显著抑制作用(P<0...     

PTEN、VEGF蛋白表达与犬乳腺肿瘤病理学特征的关系

为探讨犬的乳腺肿瘤组织中PTEN和VEGF蛋白表达与临床病理学特征关系的相关性,采用免疫组织化学SP染色法检测了32例乳腺肿瘤组织及6例正常乳腺组织中上述2种蛋白的表达。结果发现:1)PTEN蛋白在正常乳腺组织和良性乳腺肿瘤高表达率为100%,在恶性乳腺肿瘤组织中的高表达率为67%(8/12),两者比较差异极显著(P<0.01);乳腺肿瘤组织中PTEN蛋白表达与犬的年龄、肿瘤大小无关(P>0.05),而与淋巴结转移、组织学分级有关(P<0.01)。2)VEGF蛋白在正常乳腺组织中高表达率为33.3%(2/6),在乳腺肿瘤组织中高表达率为78%(25/32),两者比较差异极显著(P<0.01);乳腺肿瘤组织中VEGF蛋白表达与患病犬的年龄、肿瘤大小无关(P>0.05),而与淋巴结转移有关(P<0.05)。联合检测PTEN、VEGF表达可作为乳腺癌生物学行为和预后判断的重要指标。     

实时荧光定量PCR对犬乳腺肿瘤组织VEGF-C基因的定量检测研究

运用实时荧光PCR定量检测了38例犬乳腺肿瘤病例(包括15例良性乳腺肿瘤和23例恶性乳腺肿瘤)、4例正常乳腺组织.结果表明:在犬恶性乳腺肿瘤组织中,VEGF-C表达量明显高于良性乳腺肿瘤和正常乳腺组织,两者差异极显著(P<0.001);在伴有淋巴结转移的犬乳腺癌组织中,VEGF-C基因表达量明显高于没有发现转移的乳腺癌组织,两者差异极显著(P<0.01),但VEGF-C的表达量与肿瘤的大小和发病动物年龄无关.由此表明,VEGF-C在犬乳腺癌组织中的表达量远高于其在正常乳腺和良性乳腺肿瘤组织中的表达,且与淋巴结是否发生转移相关,因此VEGF-C有可能作为乳腺癌转移、复发的预测指标之一.     

外源性环核苷酸对山羊泌乳性能的影响

在山羊乳房基部皮下埋植外源性环核苷酸,可使血液和乳中环核苷酸浓度及其产乳量提高。统计表明,试验组与对照组之间血中的cGMP、乳中的cGMP和cAMP浓度以及产乳量均出现显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。试验组山羊的乳腺腺泡结构和机能均比对照组旺盛。     

大鼠快肌卫星细胞移植在肌肉钝挫伤模型中的修复作用

将36只成年SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为2组,试验组和对照组各18只,建立骨骼肌钝挫伤模型。采用组织块法和差速贴壁法培养与纯化快肌卫星细胞,应用免疫荧光细胞化学法进行鉴定,荧光标记后进行移植,术后5、10、15 d检测肌电生理、肌湿重、肌纤维横截面积,研究移植细胞的修复作用。免疫荧光细胞化学鉴定结果显示,快肌卫星细胞的结蛋白(desmin)、肌动蛋白(sarcomeric actin)、肌球蛋白(yosin)都呈阳性表达,成功建立了骨骼肌钝挫伤模型,且快肌卫星细胞移植处可观察到带荧光的快肌细胞核。肌电图显示,相同取材时间段试验组较对照组的波幅逐渐增高、波宽逐渐延长,整体趋于正常水平;HE染色结果显示,试验组较对照组的骨骼肌细胞排列更紧密,更具有方向性,肌纤维横截面积恢复更快;还观察到损伤大鼠随修复时间的延长逐渐恢复。方差统计结果显示,试验组与对照组的肌电生理、肌湿重恢复率、横截面积灰度值差异极显著(P0.01),三者在不同修复时间之间同样差异极显著(P0.01)。表明体外培养的快肌卫星细胞的移植对因钝挫伤而损伤的骨骼肌有明显的修复作用。