奶牛OLR1 3′UTR A223C多态的生物学信息分析

[目的]探索氧化型低密度脂蛋白受体OLR13′UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制。[方法]用miRanda（1.0）软件装载牛microRNA数据库,预测OLR13′UTR潜在的microRNA。[结果]共预测16个microRNA靶标,OLR13′UTRA223C突变定位于bta-miR-370靶标种子序列的互补区。[结论]由于OLR13′UTRA→C突变导致bta-miR-370靶标的消失,为OLR13′UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制深入研究提供依据。     

牛SLC27A1基因SNPs筛选及其与中国荷斯坦奶牛产奶性状的关联分析

[目的]对牛SLC27A1基因进行SNPs筛选并与中国荷斯坦奶牛的产奶性状进行关联分析,以期发现对中国荷斯坦奶牛产奶性状有显著影响的SNP位点。[方法]根据性能测定记录选取48头中国荷斯坦奶牛,提取血样DNA,组成2个DNA池,用于SNPs筛选,采用PCR-SSCP和克隆测序方法对DNA池进行SLC27A1基因SNPs筛选。针对发现的SNP位点,采用PCR-RFLP方法对另外231头中国荷斯坦奶牛进行群体基因型检测,采用SAS（8.02）GLM过程对各基因型与产奶性状进行关联分析。[结果]在exon3发现T112C位点,在3‘UTR发现G64A位点,T112C为同义突变;经PCR-RFLP检测,发现在T112C位点存在TT、TC、CC3种基因型,G64A位点存在GG、GA、AA3种基因型。2个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。T112C位点的CC型个体的产奶量极显著高于TC型个体（P〈0.01）,3种基因型对乳蛋白率和乳脂率影响均不显著（P〉0.05）,乳蛋白率呈现CC〉TC〉TT的趋势,乳脂率呈现TT〉TC〉CC的趋势;G64A位点3种基因型对产奶量、乳蛋白率、乳脂率的影响均不显著（P〉0.05）,但产奶量呈现GA〉GG〉AA的趋势,乳蛋白率和乳脂率呈现AA〉GG〉GA的趋势。[结论]该基因T112C位点与产奶量性状有一定的关联性,通过提高CC基因型频率有望提高中国荷斯坦奶牛的产奶量,SLC27A1基因可作为调控中国荷斯坦奶牛产奶量的候选基因,同时为该基因的标记辅助育种和进一步研究奠定了良好基础。     

牛SLC27A1基因SNPs筛选及其与中国荷斯坦奶牛产奶性状的关联分析

[目的]对牛SLC27A1基因进行SNPs筛选并与中国荷斯坦奶牛的产奶性状进行关联分析,以期发现对中国荷斯坦奶牛产奶性状有显著影响的SNP位点。[方法]根据性能测定记录选取48头中国荷斯坦奶牛,提取血样DNA,组成2个DNA池,用于SNPs筛选,采用PCR-SSCP和克隆测序方法对DNA池进行SLC27A1基因SNPs筛选。针对发现的SNP位点,采用PCR-RFLP方法对另外231头中国荷斯坦奶牛进行群体基因型检测,采用SAS（8.02）GLM过程对各基因型与产奶性状进行关联分析。[结果]在exon3发现T112C位点,在3‘UTR发现G64A位点,T112C为同义突变;经PCR-RFLP检测,发现在T112C位点存在TT、TC、CC3种基因型,G64A位点存在GG、GA、AA3种基因型。2个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。T112C位点的CC型个体的产奶量极显著高于TC型个体（P〈0.01）,3种基因型对乳蛋白率和乳脂率影响均不显著（P〉0.05）,乳蛋白率呈现CC〉TC〉TT的趋势,乳脂率呈现TT〉TC〉CC的趋势;G64A位点3种基因型对产奶量、乳蛋白率、乳脂率的影响均不显著（P〉0.05）,但产奶量呈现GA〉GG〉AA的趋势,乳蛋白率和乳脂率呈现AA〉GG〉GA的趋势。[结论]该基因T112C位点与产奶量性状有一定的关联性,通过提高CC基因型频率有望提高中国荷斯坦奶牛的产奶量,SLC27A1基因可作为调控中国荷斯坦奶牛产奶量的候选基因,同时为该基因的标记辅助育种和进一步研究奠定了良好基础。     

牛AGPAT6基因遗传特征与奶牛产奶性能相关性研究

 【目的】研究牛AGPAT6基因的遗传多态及其对奶牛产奶性能的影响，以期找到可用的分子标记，为奶牛的分子育种提供依据。【方法】利用PCR-RFLPs方法分析了3个不同品系荷斯坦牛AGPAT6基因第3内含子PstI等7种酶切多态性，分析了2个多态位点对3个品系奶牛产奶量、乳脂率、乳蛋白率及乳中体细胞评分的影响。【结果】牛AGPAT6基因第3内含子的PstI-RFLPs和BanI-RFLPs普遍存在于中国荷斯坦、澳洲荷斯坦和加拿大荷斯坦3个试验群体。PstI-RFLPs和BanI-RFLPs与荷斯坦牛的乳脂率呈显著的相关(P <0.05)；PstI-RFLPs与荷斯坦牛的体细胞评分呈显著的相关(P <0.05)；BanI-RFLPs与荷斯坦牛的305 d产奶成年当量呈显著的相关（P < 0.05)。【结论】牛AGPAT6基因第3内含子的PstI酶切位点突变，等位基因B为乳脂率和体细胞评分的优势等位基因。BanI酶切位点突变，等位基因D为乳脂率的优势等位基因；等位基因C为产奶量的优势等位基因。     

牛IRS1基因3’UTR的克隆、鉴定及生物信息学分析

以奶牛乳腺组织为材料,采用3’RACE技术克隆到奶牛IRS1基因3’UTR的全长,进一步对测得的序列进行了验证,同时利用Target Scan 7.0和Pic Tar软件预测可能结合的microRNA,并对多个软件预测结合的microRNA,进行最小结合自由能分析。结果表明,成功克隆了1 327 bp的牛IRS1 3’UTR全长,与NCBI上的预测序列一致率达到99%;miR-128、miR-96、miR-27a为2个软件共同预测到的结合microRNA;3个结合位点的最小自由能分别为-89.58、-87.91、-100.88 k J·mol-1,表明牛IRS1基因表达可能受到这3个microRNA的调控。     

中国荷斯坦牛AGPAT6基因第2内含子PCR-SSCP分析

[目的]寻找影响奶牛产奶性能的候选基因。[方法]以中国荷斯坦牛为研究对象,采用PCR．SSCP方法对AGPAT6基因第2内含子进行单核苷酸多态性检测并分析多态位点对奶牛产奶量、乳脂率、乳蛋白率和乳中体细胞评分的影响。[结果]扩增出462bp的中国荷斯坦牛AGPAT6基因第2内含子;PCR—SSCP分析该基因第2内含子有AA、AB和BB3种基因型,其频率分别为0．1511、0．6578和0．1911;不同基因型与中国荷斯坦牛产奶量、乳脂率和乳蛋白率之间显著相关（P〈0．05）,与体细胞评分相关不显著（P〉0．05）。[结论]初步认为AGPAT6是影响奶牛产奶性能的一个候选基因或分子标记,该研究为奶牛选育提供了理论依据。     

不同年龄·胎次和泌乳月对奶牛乳脂率的影响

[目的]研究不同年龄、胎次和泌乳月对奶牛乳脂率的影响。[方法]对宁夏平吉堡奶牛场1 500头成年奶牛乳脂率进行测定,研究不同年龄、胎次和泌乳月对奶牛乳脂率的影响。[结果]奶牛平均乳脂率为3.64%,随着年龄的增长而逐渐下降,乳脂率由4岁的3.94%降至9岁的3.54%;奶牛平均乳脂率随着胎次的增加也逐渐下降,由1胎的4.03%降至8胎的3.26%;奶牛平均乳脂率随着泌乳月的延长而呈两头高中间低的变化趋势。[结论]该研究结果对今后的奶牛生产具有一定的指导意义。     

中国荷斯坦奶牛LOX-1基因3′UTR的PCR-SSCP分析

为了寻找影响奶牛产奶性状的候选基因,采用PCR-SSCP分子标记方法,对中国荷斯坦奶牛LOX-1基因3′非编码区进行了多态性分析。结果表明,在中国荷斯坦奶牛中检测的LOX-1基因3′UTR有AA型、BB型和AB型3种基因型,其频率分别为0.1374,0.3130和0.5496;不同基因型与中国荷斯坦奶牛的乳脂率之间有显著的相关性(P<0.05),但对乳蛋白率、产奶量和体细胞评分(SCS)影响不大,未达到显著水平。初步认为LOX-1基因可能是控制中国荷斯坦奶牛产奶性能的一个候选基因,或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。     

青藏高原海东鸡CAPN3基因第1外显子多态性研究

[目的]对青藏高原海东鸡CAPN3基因第1外显子的多态性进行研究。[方法]采用PCR-SSCP技术检测海东鸡CAPN3基因第1外显子的多态性。[结果]海东鸡CAPN3基因第1外显子存在c.223GA的错义突变,对应2种等位基因G和A,等位基因G为优势等位基因;该群体CAPN3基因检测区域0.25PIC≤0.5为中度多态,且偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P0.01)。[结论]该研究为海东鸡功能基因的分子遗传研究提供了基础资料。     

中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联分析

 【目的】研究中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因第4和第5外显子多态性与泌乳性状的关联性,为培育高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供参考依据。【方法】采用DNA测序、PCR-RFLP和CRS-PCR技术,对544头中国荷斯坦牛κ-酪蛋白基因的外显子4和5序列进行研究,通过SHEsis 软件和PHASE软件进行配对连锁不平衡分析和单倍型分析。【结果】发现6个新的SNPs,包括外显子5上A12907G、G12950A、C12989T、A13028G、T12980C共5个SNP位点,证实前4个位点紧密连锁;外显子4上A10996T共1个SNP位点。单位点基因型与泌乳性状关联分析表明,A10996T突变位点的TT和AT基因型个体乳脂率显著高于AA基因型个体(P＜0.05);T12980C突变位点的TC和CC基因型个体乳脂率、乳蛋白率分别极显著(P＜0.01)、显著(P＜0.05)高于TT基因型个体;紧密连锁的4个突变位点的DE基因型个体乳脂率极显著高于DD基因型个体(P＜0.01)。与泌乳性状的关联分析表明,共构建出7种单倍型,发现16种单倍型组合;其中H6H6单倍型组合个体乳脂率最高,H1H4次之;H1H4单倍型组合个体乳蛋白率最高;H5H6单倍型组合个体乳蛋白率及乳脂率最低。【结论】H1H4单倍型组合在乳蛋白率和乳脂率方面为有利单倍型组合,可作为选择高乳蛋白高乳脂率牛群的分子标记。     

中国荷斯坦奶牛LOX-1基因3′UTR的PCR-SSCP分析

为了寻找影响奶牛产奶性状的候选基因，采用PCR-SSCP分子标记方法，对中国荷斯坦奶牛LOX-1基因3′非编码区进行了多态性分析。结果表明，在中国荷斯坦奶牛中检测的LOX-1基因3′UTR有AA型、BB型和AB型3种基因型，其频率分别为0．1374，0.3130和0．5496；不同基因型与中国荷斯坦奶牛的乳脂率之间有显著的相关性（P〈O．05），但对乳蛋白率、产奶量和体细胞评分（SCS）影响不大，未达到显著水平。初步认为LOX-1基因可能是控制中国荷斯坦奶牛产奶性能的一个候选基因，或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。     

纯血马和百色马IGF1R基因蛋白编码区序列的多态性分析

[目的]研究纯血马和百色马IGF1R基因成熟蛋白编码区序列的多态性,为揭示马矮小性状的分子机理和马的分子育种提供理论参考。[方法]采集纯血马和百色马的血样各57份,按常规酚仿法抽提DNA。利用DNA混合池和PCR产物直接测序的方法检测IGF1R基因的多态位点,利用PCR-RFLP技术分析这些多态位点在纯血马和百色马中的基因型及其频率分布。[结果]在马IGF1R基因的第2、第5和第16外显子上存在4个多态位点,其中突变179627 T→C为纯血马和百色马共有,且两者在基因型频率上差异不显著;突变212077 G→A为纯血马所独有;突变406 T→C和212 110 G→A为百色马所独有。[结论]马IGF1R基因的多态位点可能与百色马的矮小和纯血马的高大有关。     

中国荷斯坦奶牛PPARGC1A基因内含子9的SNP与产奶性状的相关分析

采用PCR产物直接测序的方法,对213头中国荷斯坦奶牛的PPARGC1A基因进行单核苷酸多态性分析,并研究不同基因型与产奶性状的相关关系。结果表明,PPARGC1A基因内含子9存在C>T SNP位点,可分为有CC、CT和TT这3种基因型,基因型频率分别为0.3568、0.6291和0.0141;该位点突变偏离Hardy-Weinberg平衡状态且中度多态;CC基因型与中国荷斯坦奶牛的乳脂肪率显著相关。PPARGC1A基因可以作为研究中国荷斯坦奶牛泌乳性状的候选基因。     

中国荷斯坦奶牛乳脂中miR-2285f生物信息学分析及靶基因验证

旨为探索bta-miR-2285f和宿主基因TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)的生物学功能,以及bta-miR-2285f与靶基因互作调节奶牛乳脂代谢的潜在机制,本研究通过生物信息学方法分析bta-miR-2285f在不同物种间的保守性,并通过上游序列CPG岛分析、启动子预测、进一步进行组织表达谱分析,预测靶基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用双荧光素酶报告试验验证bta-miR-2285f调控的下游靶基因钙结合蛋白39(Calcium binding protein 39,CAB39),并在乳腺上皮细胞水平探究bta-miR-2285f的功能作用。结果表明：1)bta-miR-2285f是牛特异性miRNA,属于内含子miRNA;2)bta-miR-2285f与宿主基因TBK1上游序列2 kb处均不含有CPG岛。bta-miR-2285f在上游586 bp处为转录起始位点。宿主基因TBK1在上游105 bp处为转录起始位点;3)TargetScan和miRWalk预测miR-2285f有172个交集靶基因,主要参与新陈代谢、遗传信息传...     

牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建

为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。     

荷斯坦奶牛HSP70-A8基因多态性及其与DHI测定性能的关联分析

以319头荷斯坦奶牛为材料,采用PCR-SSCP方法检测牛群HSP70-A8基因的多态性,并对其与DHI测定性能进行关联分析。结果表明,在荷斯坦奶牛HSP70-A8基因的第1外显子1522 bp处发生GC突变,检测到AA、AB和BB 3种基因型,其中AA基因型频率为38.56%,AB基因型频率为31.03%,BB基因型频率为30.41%;多态信息含量(PIC)为0.3733,在该位点均处于中度多态;卡方检验表明该荷斯坦奶牛群体处于哈迪-温伯格非平衡状态;群体HSP70-A8的第2至8外显子都没有检测到多态。关联分析结果表明,BB基因型荷斯坦奶牛个体总产奶量、标准乳总产奶量、305 d标准乳产量、305 d乳脂产量、305 d乳蛋白产量、总乳脂产量和总乳蛋白产量皆极显著高于AA型个体和AB型个体(P0.01),AA基因型个体体细胞数极显著低于AB型个体和BB型个体(P0.01)。因此,HSP70-A8基因第1外显子该位点的多态性可以作为奶牛生产性能选择的候选分子遗传标记。     

中国荷斯坦奶牛DGAT1基因3′UTR的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP分子标记方法对中国荷斯坦奶牛DGAT1基因3′非翻译区进行了多态性分析。结果表明:在中国荷斯坦奶牛中检测的DGAT1基因3′UTR有AA型、BB型和AB型3种基因型,其频率分别为0.2931,0.0431,0.6638;不同基因型与中国荷斯坦奶牛的乳蛋白率和乳脂率有极显著和显著的相关性(P<0.01和P<0.05),BB型产奶量均显著高于AA型和AB型(P<0.05),基因型对SCS影响不大,没有达到显著水平。     

中国荷斯坦奶牛Nramp1基因多态性与泌乳性状及产奶量的关联性分析

为寻找与乳房炎相关的分子标记,为荷斯坦牛的抗病育种提供理论基础,试验采用PCR-SSCP技术和测序的方法对宁夏农垦303头中国荷斯坦奶牛的Nramp1基因进行了遗传多态性分析,利用一般线性模型分析Nramp1基因c.200CG突变对泌乳性状及产奶量影响。结果显示,Nramp1基因c.200CG突变与乳脂率、日产奶量和体细胞评分值存在显著(P0.05)或极显著(P0.01)关联。因此,可以把该位点作为中国荷斯坦奶牛体细胞评分、测定日产奶量和日乳脂率的遗传标记进行进一步研究。     

荷斯坦母牛PPARGC1A基因多态性与产奶性状关联分析

设计18对引物,采用PCR-RFLP、PCR-PAGE及PCR-SSCP技术检测过氧化物酶增殖激活受体γ辅激活蛋白1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma eoactivator 1 alpha,PPARGC1A)基因在435头荷斯坦母牛中的多态性,分析该基因对荷斯坦母牛5个产奶性状(305 d产奶量、蛋白率、乳脂率、乳糖率、干物质率)的影响.结果表明仅引物P1、P2、P16和P18扩增片段存在多态性.引物P1扩增片段经HaeⅢ酶切产生CC、CT、TT 3种基因型:TT和CT基因型乳脂率最小二乘均值显著高于CC基因型所对应的值(P<0.05),TT和CT基因型乳脂率最小二乘均值差异不显著(P0.05).引物P2扩增片段经Nhe Ⅰ酶切产生从、AC、CC 3种基因型;AA和AC基因型蛋白率最小二乘均值显著高于CC基因型所对应的值(P<0.05),AA和AC基因型蛋白率最小二乘均值差异不显著(P0.05).对于引物P16扩增片段,检测到EE、EF、FF 3种基因型;EE、EF和FF基因型5个产奶性状最小二乘均值差异均不显著(P0.05).对于引物P18扩增片段,检测到GG、GH、HH 3种基因型;GG、GH和HH基因型5个产奶性状最小二乘均值差异均不显著(P0.05).本研究结果初步表明PPARGCIA基因C85330T多态位点的T等位基因是提高奶牛乳脂率的一个潜在DNA标记,A103592C多态位点的A等位基因是提高奶牛乳蛋白率的一个潜在DNA标记.     

牦牛DGAT1基因多态性及其与乳质性状关联分析

【目的】检测牦牛DGAT1基因多态性,评估基因突变对牦牛乳品质性状的影响,以期丰富牦牛重要经济性状的分子遗传研究基础。【方法】采用PCR-SSCP方法,检测甘南牦牛、天祝白牦牛、青海牦牛及野血牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17区突变,分析基因突变对乳品质性状的影响。【结果】牦牛DGAT1基因intron5-exon7区发现c.562+32_c.562+33ins CCGCCC的插入/缺失,等位基因M、基因型MM频率最高为优势等位基因和基因型,各类群牦牛PIC0.5属中度或低度多态;intron15-exon17区检测到c.1249-23CT和c.1336CT的突变,其中exon17发现的c.1336CT突变导致编码氨基酸p.Arg447Cys转变,等位基因A频率最高为优势等位基因,甘南牦牛、天祝白牦牛和青海牦牛中基因型AA为优势基因型,野血牦牛基因型AB为优势基因型,各类群牦牛0.25PIC0.5属中度多态;两区域3处突变位点构建出6种单倍型和11种单倍型组合,突变位点间存在连锁关系且接近于连锁平衡。关联分析表明,甘南牦牛intron5-exon7区基因型与乳质性状无显著相关;intron15-exon17区基因型BB个体乳品质性状最低,且乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量中显著低于其他基因型个体(P0.05);携带等位基因A的个体乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量及无脂固体含量显著高于未携带者(P0.05),携带等位基因C的个体乳脂率也显著高于未携带者(P0.05),而携带等位基因B的个体乳脂率、总固体物质含量显著低于未携带者(P0.05);单倍型组合H1H3个体的乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量和无脂固体物质含量均较高,且乳脂率及总固体物质含量显著高于其他单倍型组合(P0.05),而H2H2单倍型组合个体则较低,除乳糖率以外的其他乳品质性状均显著低于其他7种单倍型组合(P0.05)。【结论】牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17区为低度和中度多态,intron6存在c.562+32_c.562+33ins CCGCCC的插入/缺失,intron15和exon17分别检测到c.1249-23CT突变和c.1336CT的非同义突变。intron15-exon17区突变影响甘南牦牛乳品质性状,选留携带等位基因A的个体和淘汰携带等位基因B的个体、或选留H1H3单倍型组合及淘汰H2H2单倍型组合个体,均可显著改善后代群体的乳品质。