迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

壳寡糖对红鳍东方鲀血液指标和非特异性免疫指标的影响

为研究壳寡糖(chitosan-oligosaccbarides,COS)对红鳍东方鲀Takifugu rubripes血清和血液生化指标及非特异性免疫指标的影响,选用体质量为(129.2±3.1)g的红鳍东方鲀600尾,随机分为C0、C1、C2、C3 4组,每组设3个平行,在基础饲料中分别添加0、500、1000、2000 mg/kg的壳寡糖,经56 d饲养后,测定其血液指标、抗氧化酶活性及其攻毒耐受性。结果表明:饲料中添加壳寡糖能显著提高血清中碱性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力和全血中血小板数量(P0.05),各项指标随壳寡糖添加量的增加整体呈升高趋势;饲料中添加壳寡糖能显著提高红鳍东方鲀肝脏组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力(P0.05),显著降低丙二醛含量(P0.05);壳寡糖能明显提高红鳍东方鲀对迟缓爱德华氏菌和哈维弧菌的抵抗力。研究表明,在本试验条件下,饲料中添加2000 mg/kg壳寡糖能够提高红鳍东方鲀的非特异性免疫功能。     

感染迟缓爱德华氏菌杂交鳢血清指标动态变化

[目的]研究感染迟缓爱德华氏菌后杂交鳢血清指标的动态变化。[方法]杂交鳢人工感染迟缓爱德华氏菌后,测定其血清指标的水平,并分析其动态变化特征。[结果]不同时间点感染组血糖浓度的平均值逐渐升高;不同时间点总蛋白、球蛋白、总胆红素、尿酸、尿素氮、肌酐、钙离子浓度的平均值以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、酚氧化酶活力的平均值先升高后降低,但不同时间点感染组的尿素氮之间无显著性差异(P0.05);淀粉酶、酸性磷酸酶的活力则先降低后升高。不同时间点对照组上述指标之间无显著性差异(P0.05)。[结论]杂交鳢感染迟缓爱德华氏菌后,除球蛋白和尿素氮外,其他血清指标相比对照组均发生了明显的异常变化(P﹤0.05),但最终大多数指标恢复至对照组水平。     

河蟹常见疾病及其防治（一）

病因：迟钝爱德华氏菌、弧菌(弗歇氏弧菌，哈维氏弧菌等)，嗜水气单胞菌及病毒等。可分为慢速死亡和快速死亡两种。症状：病蟹步足环起不能伸展，动弹，并发生阵阵抖动，不久死亡。部分病蟹肝部发黑、发白，坏损至死，鳃溃疡缺损。(见图)     

养殖不同海水鱼的同种循环水系统中除磷细菌组成及特性

以点带石斑鱼(W池)、大菱鲆(D池)、红鳍东方鲀(H池)及半滑舌鳎(B池)4个鱼种循环水养殖系统净化池中采集水样为对象,采用平板分离法及液体培养法定量研究具有除磷能力的细菌及其特性。结果表明,4个系统中共培养16株除磷细菌;其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌具有较强的除磷能力和效果(皮特不动杆菌创伤弧菌哈夫尼希瓦氏菌副溶血弧菌);总除磷能力与细菌总浓度呈正相关;4种细菌去除NH4+-N效果为哈夫尼希瓦氏菌副溶血弧菌皮特不动杆菌创伤弧菌;其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌具有除TN能力,去除TN的效果为皮特不动杆菌哈夫尼希瓦氏菌=创伤弧菌。     

溶藻弧菌对罗氏沼虾成活率及5种酶活性的影响

用溶藻弧菌对体重为23.86(±3.95)g的健康罗氏沼虾分别进行浸浴、投喂和注射感染试验,并在注射感染96 h内和20 d后测定虾组织中过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、酸性磷酸酶(ACP)及碱性磷酸酶(AKP)的活性。结果显示:注射感染对罗氏沼虾的致死作用最明显,其中培养物离心液组罗氏沼虾的成活率最低。感染96h内CAT、T-SOD、GSH-Px和AKP的活性变化较为显著;感染20 d后仅肌肉组织T-SOD和ACP活性各组间存在显著差异。结果表明,培养物离心液的毒性很强;注射感染较适合短时间内取样感染;酶活测定感染浓度应选择106cell/mL;溶藻弧菌对罗氏沼虾免疫相关酶活指标的影响较大,其中CAT、T-SOD、GSH-Px和AKP对病原反应较为敏感。     

仿刺参不同组织液的抗菌活性

采用平板菌落计数法测定仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液和体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌Vibrio harveyi的抑制作用,并对健康仿刺参与感染后仿刺参的体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用进行了比较;采用乙醇沉淀、离心等方法从仿刺参体壁内皮组织中粗提得到一种水溶性成分,测定了该成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌Staphylococcus albus和迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda的抑菌活性,并初步研究了该成分的基本性质。结果表明：仿刺参体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌的抑制效果显著,体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液对哈氏弧菌的抑制效果不显著;感染状态下,仿刺参体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用与健康状态相比有所降低。提取的水溶性成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌和迟钝爱德华氏菌均有明显的抑制作用;该成分的茚三酮反应呈阳性,其中蛋白质的质量分数为17.48%;该成分经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到5个蛋白条带,相对分子质量大约为55 300、46 100、34 700、19 500和14 500,初步认为其含有肽类抗菌活性物质。     

应用Dot-IGS快速检测牙鲆腹水病病原的研究

[目的]建立一种简便快速检测迟钝爱德华氏菌的斑点免疫金染色诊断方法。[方法]选用硝酸纤维素膜作固相载体,以胶体金标记羊抗兔IgG,根据棋盘试验,确定Et免疫血清和金标抗体最佳工作浓度,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。[结果]迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。[结论]Dot—IGS方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。     

地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴定及毒力基因的检测

从患病地图鱼Astronotus ocellatus肝脏组织中分离到菌株AO1,经人工感染试验证实其为致病菌。通过ATB Expression半自动细菌鉴定仪和常规生理生化特性的分析,初步鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌Ed-wardsiella tarda。测定菌株AO1的16S rRNA基因序列并进行分析,结果显示,该菌株与迟钝爱德华氏菌的同源性最高,达99.9%。因此,可鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌。根据迟钝爱德华氏菌的毒力基因菌毛亚基(fimA)基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到383 bp序列,该序列与迟钝爱德华氏菌的fimA基因序列相似性达99.0%,进一步说明菌株AO1具有fimA基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株AO1对阿米卡星、氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、氨苄西林、氨曲南、卡那霉素、头孢咪啉、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、妥布霉素、氨苄青霉素13种抗生素较为敏感。     

人工感染3种弧菌对鲻鱼血清酶活力的影响

[目的]了解病原菌对鲻鱼非特异性免疫功能的影响,为鲻鱼细菌性疾病的免疫防治提供参考依据.[方法]采用腹腔注射法将等比例混合浓度为4.5× 106 CFU/mL的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、创伤弧菌（Vibriiovulnificus）和哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）混合菌悬液人工感染鲻鱼,对照组注射等量灭菌生理盐水,分别在感染后第0、1、3、7、11、15、19、23、27、31和35 d采集血样测定血清中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）活力的变化.[结果]鲻鱼在感染3种弧菌混合悬液后第3d开始出现发病症状,其血清中的溶酶体酶（ACP、AKP和LSZ）活力总体上呈先降低后升高再降低的变化趋势;抗氧化酶（SOD和POD）活力也呈先降低后升高再降低的变化趋势;氨基转移酶（GOT和GPT）活力在感染初期呈急剧上升态势,而后下降回归至正常水平.[结论]鲻鱼受到外源微生物（弧菌混合悬液）刺激后,其体内非特异免疫系统被激活、组织（肝脏）受到损伤,即血清中非特异免疫酶可作为鉴定鱼体健康状况的指标.     

Cu（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）对克氏原螯虾代谢酶的影响

将体质量为（11.35±1.52）g克氏原螯虾Procambarus clarkii暴露于不同亚致死浓度的Cu（Ⅱ）（0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L）和Cd（Ⅱ）（0.0048、0.024、0.12、0.60、3.00 mg/L）溶液中96 h,测定其肌肉中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）及肝胰腺中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）的活性。结果表明：低浓度的Cu（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）能诱导克氏原螯虾代谢酶的活性,肌肉和肝胰腺中代谢酶的活性均随Cu（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）浓度的升高呈先升后降的趋势;Cd（Ⅱ）浓度为0.12 mg/L时,肝胰腺中ACP、AKP、GPT、GOT活性均达到最大值,分别较对照组提高了58.83%、86.17%、85.66%、70.98%（P〈0.05）;Cu（Ⅱ）浓度为0.28 mg/L时,肝胰腺中ACP和AKP活性达最大值,分别较对照组提高了112.53%和94.98%（P〈0.05）,Cu（Ⅱ）浓度为1.38mg/L时,肌肉中ACP和AKP活性最高,分别较对照组提高了242.35%和171.97%（P〈0.05）。     

不同盐度对脊尾白虾非特异性免疫及抗氧化酶活性的影响

为了研究不同盐度对脊尾白虾免疫水平的影响,实验对5个盐度组脊尾白虾的肝胰腺和肌肉组织中的非特异性免疫及抗氧化酶相关的酶活性进行了比较分析。结果表明,除LSZ酶活外,不同酶活在肝胰腺中的分布均高于肌肉;除肌肉中的LSZ酶活外,不同盐度组间的免疫酶活性有显著差异。ACP、AKP酶活在肝胰腺中分布以26.6盐度组最高,显著高于11.0、16.2、21.4盐度组（P〈0.05）;不同盐度间脊尾白虾肝胰腺中LSZ酶活差异显著（P〈0.05）,以26.6盐度组酶活最高;T-AOC、SOD酶活在肝胰腺中的分布差异显著（P〈0.05）,以31.8盐度组最高,21.4盐度组最低。     

盐度胁迫对锯缘青蟹体内腺苷三磷酸酶和磷酸酶活性的影响

采用酶学分析的方法研究了盐度（分别为5、15、25、35）胁迫下锯缘青蟹鳃、肌肉和肝胰腺中腺苷三磷酸酶和磷酸酶活性变化。结果表明，随着盐度降低，青蟹鳃中Na^＋，K^＋-ATPase、Ca^2＋，Mg^2＋-ATPase活性均升高，随着胁迫时间延长，Na^＋，K^＋-ATPase活性呈现不同的变化规律，且趋于平缓。青蟹肌肉中ACP活性随着盐度的升高而呈小幅度下降，而肝胰腺中ACP活性则呈小幅度升高，但各组之间差异不显著（P〉0.05）。不同胁迫时间同一盐度组青蟹肌肉中的ACP活性有升有降。青蟹肌肉、肝胰腺中AKP活性随着盐度升高而升高;随着胁迫时间延长，同一盐度组青蟹肌肉中AKP活性均呈升高趋势，肝胰腺中AKP活性有升有降。由此可见，盐度对青蟹生理生化影响显著。     

复方中草药饲料添加剂对克氏原螯虾非特异性免疫功能的影响

[目的]探讨复方中草药饲料添加剂对克氏原螯虾非特异性免疫功能的影响。[方法]在基础饲料中添加1%、2%的复方中草药制剂,连续投喂40 d,分别在养殖后的20、30、40 d测定克氏原螯虾的溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性。[结果]与对照组相比,添加1%和2%的中草药制剂对克氏原螯虾溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性影响极显著(P<0.01),对碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性影响显著(P<0.05)。2个试验组除酸性磷酸酶外,其他3种酶的活力均无显著差异(P>0.05)。[结论]复方中草药饲料添加剂可以显著提高克氏原鳌虾的非特异性免疫功能。从免疫力和经济角度方面考虑,建议中草药的添加剂量以1%为宜。     

毒死蜱致2种作物中可溶性蛋白及相关酶的活性变化

为探讨农药"毒死蜱"与韭菜中解毒代谢酶的关系,本试验以毒死蜱喷施韭菜,研究了不同作用时间韭菜中可溶性蛋白质含量,谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、酸性磷酸酯酶(ACP)、碱性磷酸酯酶(AKP)活性的变化动态并以小白菜与之对照。结果表明:韭菜和小白菜可溶性蛋白在受到毒死蜱作用时,其蛋白含量变化动态型式基本一致,呈立即升高随后降低又升高的趋势,并分别在14和5d恢复到正常水平;GST,GSH-PX的活性在韭菜中的变化不明显,在小白菜中程上升趋势;正常情况下2种蔬菜中ACP的活性是AKP的100倍左右,受胁迫时韭菜两磷酸酯酶变化不大,小白菜的两磷酸酯酶活性在作用后期迅速下降。毒死蜱在小白菜中的作用时间比韭菜短;小白菜的解毒代谢酶活性较韭菜高;小白菜能够更好的保护细胞膜结构并维护自身功能的完整。     

壳寡糖对三疣梭子蟹免疫力的影响

为研究壳寡糖对三疣梭子蟹免疫功能的影响,设置了含壳寡糖0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg（分别为T0、T1、T2、T3和T4组）的5组试验饲料饲喂三疣梭子蟹,分别在第10 d、20 d和30 d取血清进行酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LSZ）和过氧化物酶（POD）活性的测定,试验结束时测定血细胞的密度。结果显示,在基础饲料中添加适量的壳寡糖可以显著性提高ACP、T-SOD、LSZ、POD活力（P〈0.05）,对PO和AKP活力促进效果不显著（P〉0.05）。壳寡糖可以显著提高三疣梭子蟹血细胞密度（P〈0.05）,对3种血细胞所占比例有一定的影响（P〉0.05）。综合考虑,T2、T3组对三疣梭子蟹免疫促进效果较好,建议基础饲料中壳寡糖添加量为1.0～1.5 g/kg。     

枯草芽孢杆菌对三疣梭子蟹免疫指标、生长性能及养殖水质的影响

[目的]探讨枯草芽孢杆菌对三疣梭子蟹饲养效果的影响,为开展三疣梭子蟹高效健康养殖和促进益生菌在蟹类养殖领域的推广应用提供参考依据.[方法]以三疣梭子蟹为研究对象,分别设试验组(EG,添加2×1010 CFU/g枯草芽孢杆菌)和对照组(CK,不添加任何益生菌),试验周期28 d,期间定期检测生长指标和水质因子,试验结束时测定三疣梭子蟹血淋巴中的碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和溶菌酶(LZM)等相关酶活力.[结果]枯草芽孢杆菌可显著提高三疣梭子蟹血淋巴中的AKP活力(P<0.05,下同),随着养殖时间推移,AKP活力逐渐升高;而ACP和POD活力均呈先升高后降低的变化趋势,于第21 d时达最高值,分别为6.47 U/100 mL和45.93 U/mL,显著高于CK组;枯草芽孢杆菌对三疣梭子蟹血淋巴T-SOD活力无显著影响(P>0.05),但对LZM含量有明显影响,也于第21 d时达最高值(3.81μg/mL),此后LZM含量维持在相对较稳定的水平.枯草芽孢杆菌对三疣梭子蟹的生长促进作用不明显,但能显著提高其存活率,至试验结束时三疣梭子蟹存活率较CK组提高了17.78%(绝对值).枯草芽孢杆菌对三疣梭子蟹养殖水体氨氮(NH3-N)和亚硝态氮(NO2--N)有显著的降低作用,但在21 d后作用效果略有下降.[结论]枯草芽孢杆菌能显著影响三疣梭子蟹免疫相关酶活力,提高其存活率,且能有效降低养殖水体中的NH3-N和NO2--N含量,进而达到净化养殖水质的效果.     

人工感染呼肠孤病毒对拟穴青蟹部分免疫因子的影响

采用注射和浸泡的方式人工感染拟穴青蟹呼肠孤病毒,研究了其对拟穴青蟹血细胞密度以及血清中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）和碱性磷酸酶（AKP）活力的影响.结果表明：注射（第Ⅱ组）和浸泡（第Ⅳ组）方式均能感染健康青蟹,病发死亡时间为7～9 d,死亡率达100%,血细胞平均密度在试验36～72 h间迅速上升并达最高值,其血细胞密度最高值分别为1.4008×107cells/mL与1.8243×107cells/mL;感染病毒的青蟹PO活性均大致呈现下降的趋势,其中,第Ⅳ组感染12 h青蟹PO活性相对对照组显著升高（P〈0.05）,其值为（6.90±1.54）,达实验所测PO活性最高值;各实验组血清SOD活性呈无规律的变化;AKP活性感染组与对照组表现不同.表明测定血细胞密度以及PO和AKP活性可用来辅助诊断青蟹疾病,而SOD活性变化不能很好地表征青蟹受病毒感染的状况.