单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的 原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。     

模拟胃液对Pena 1及其抗原表位免疫原性的影响

【目的】Pen a 1是虾中的主要过敏原,已知其5个抗原表位在过敏反应中起着决定性的作用。用全蛋白抗体和表位特异性抗体,检测Pen a 1经体外模拟胃液（simulated gastric fluid,SGF）消化后其抗原表位免疫原性的变化情况,为研究人体消化对Pen a 1的影响机理及脱敏食品的制备提供理论依据。【方法】以刀额新对虾(metapenaeus ensis）为原材料,提取纯化虾过敏原Pen a 1,采用Fmoc化学法合成Pen a 1抗原表位的5个多肽片段(No.1-No.5),分别与载体蛋白KLH和牛血清蛋白BSA偶联制备人工免疫原和包被原。用Pen a 1和制备的多肽免疫原免疫新西兰纯种白兔获得全白蛋抗体和特异性表位抗体。参照美国药典模拟人体胃液的条件消化处理Pen a 1,利用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE观察消化后Pen a 1分子量变化;通过免疫印迹(Western-blot)定性观察Pen a 1消化后生成的新蛋白片段与各抗体的结合情况;再经竞争抑制酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）定量检测消化后的Pen a 1和表位多肽与各抗体结合能力,从而得出Pen a 1经SGF消化后各抗原表位免疫原性的变化程度。【结果】SDS-PAGE结果显示Pen a 1随SGF消化时间的延长逐渐被降解,在22 kD处生成一些较稳定的新蛋白片段,Tricine-SDS-PAGE结果表明在1.7-18 kD之间无新蛋白片段生成。Western-blot表明消化后分解生成的小分子蛋白与六种抗体发生不同程度结合,其中全蛋白抗体和No.4抗体几乎与生成的所有小分子蛋白结合,在22 kD左右处生成的稳定新蛋白片段均与No.3、4、5抗体有较强的结合,而与No.1、2抗体结合较弱甚至无结合,表明该蛋白携带No.3、4、5表位,而基本无No.1、2表位。ci-ELISA结果显示,Pen a 1经SGF消化后对全蛋白抗体和5个表位抗体的抑制率均显著下降,说明经过消化后Pena1及其抗原表位的免疫原性均明显降低,各抗原表位消化稳定性排序为No.4＞No.2>No.1>No.3＞No.5,其中No. 2、1、3之间无显著性差异;ci-ELISA检测表位多肽经消化后其免疫原性也显著下降,消化稳定性排序为No.1> No.2 >No.3＞No.4＞No.5,其中No.2、3、4之间无显著性差异。结合免疫印迹结果可知No.4抗原表位消化稳定性最高,但其表位多肽消化稳定性没有显著高于其它所有表位多肽,说明在消化过程中Pen a 1结构对该表位起到一定的保护作用,使其保持较高的消化稳定性;No.1、2、3次之,3个表位间无显著性差异;No.5消化稳定性最差,表明Pen a 1空间结构对其无明显保护作用。【结论】建立了一种用表位抗体检测过敏原经模拟消化后抗原表位消化稳定性的方法。Pen a 1经SGF消化后,免疫原性降低,分解生成部分较稳定的蛋白片段,但仍具有致敏性;5个抗原表位中No.4消化稳定最高,No.5最差。     

绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

动物可食性组织中克拉维酸残留HPLC-MS/MS检测方法

【目的】建立动物可食性组织中克拉维酸残留检测的高效液相色谱-串联质谱方法。【方法】1 g组织样品用3 mL 0.01 mol•L-1乙酸铵和3 mL乙腈提取后,经二氯甲烷反相提取净化,取水相定容到4 mL,正己烷除脂后上机检测。流动相为乙腈和0.1%甲酸水,梯度洗脱,经Luna 5μ C8色谱柱分离,采用电喷雾电离,多反应监测负离子模式对克拉维酸进行定量分析。【结果】采用基质匹配法对组织中克拉维酸的含量进行标准校正,克拉维酸质量浓度在5—500 μg•L-1范围内与峰面积间呈现良好的线性关系（r＞0.999）;组织中加标样品的检出限（按信噪比S/N≥3计）为10 μg•kg-1,定量限（按信噪比S/N≥10计）为20 μg•kg-1。在定量限、1/2最高残留限量、最高残留限量、2倍最高残留限量4个添加水平下,组织中克拉维酸的平均回收率为76.39%—89.26%,日间相对标准偏差为1.89%—6.20%。【结论】该方法可用于动物可食性组织中克拉维酸残留的分析检测。     

不同装烟方式对烤烟烘烤烟叶品质和安全性的影响

【目的】探讨装烟方式和烤烟中烟叶品质形成的机理,进一步提高烤烟烘烤烟叶质量和安全性。【方法】研究普通挂竿（T1）、密集挂竿（T2）和散叶插扦（T3）烘烤过程中烟叶水分、类胡萝卜素和叶表提取物组分含量的变化,分析烤后烟叶主要化学成分、中性香味物质、烟气有害成分含量及感官质量的差异。【结果】烘烤中T3处理烟叶失水较慢,48—72 h与T2处理差异显著（P＜0.05）。T3处理烘烤中烟叶β-胡萝卜素与叶黄素含量降幅分别为62.91%和69.45%,大于T1（57.59%、65.19%）和T2处理（57.59%、60.31%）,烤后烟叶含量最低。T1和T3处理烤后烟叶腺毛分泌物含量较高,损失率分别为8.82%和10.52%,T2处理含量最低,损失率为54.05%;T3处理烤后烟叶表面烷烃类含量最高,损失率为13.80%,T2处理最低,损失率为58.91%。T3处理烤后烟叶糖碱比值（10.67）较适宜,感官评吸分值（60.75分）和中性香味物质含量最高（1 186.65 μg•g-1）。不同处理烤后烟叶烟气羰基化合物含量大小表现为：T3（1 034.08 μg•cig-1）＜T1（1 144.76 μg•cig-1）＜T2（1 251.19 μg•cig-1）,其中T1和T2差异显著（P＜0.05）;烟气酚类物质含量大小表现为：T3（149.93 μg•cig-1）＜T2（157.71 μg•cig-1）＜T1（175.60 μg•cig-1）。T3处理巴豆醛、CO和苯并[a]芘含量最低;T2和T3处理HCN含量较低,且显著低于T1处理（P＜0.05）。【结论】与T1和T2相比,T3处理烘烤中烟叶失水较慢,类胡萝卜素降解较充分,烤后烟叶化学成分更协调,香味物质含量和感官评价分值较高,烟气有害成分含量较低,烤后烟叶质量综合评价最佳。     

天名精内酯酮多克隆抗体的制备

【目的】合成并鉴定天名精内酯酮人工抗原,制备天名精内酯酮多克隆抗体,为天名精内酯酮作用靶标的免疫化学定位奠定基础。【方法】通过天名精内酯酮4位羰基和盐酸氨基脲氨基的亲核加成反应制备半抗原天名精内酯酮缩氨基脲(CN),使用MS和NMR对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原和载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成天名精内酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA),采用紫外吸收扫描法、红外光谱法对免疫原及包被原进行鉴定;用制备好的免疫原免疫健康BALB/c小鼠获得天名精内酯酮多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA法测定其效价。【结果】成功制备了天名精内酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA),获得了效价为128 000的天名精内酯酮多克隆抗体。【结论】成功制备了天名精内酯酮多克隆抗体。     

中华猕猴桃褐斑病病原鉴定及抑菌药剂筛选

【目的】确定引起中华猕猴桃褐斑病病原菌种类,研究常用杀菌剂对该病原菌菌丝生长的抑制作用。【方法】对病原菌进行分离、纯化、致病性测定以及形态学、分子生物学鉴定,确定病原菌种类;选用常用的18种杀菌剂分别对病原菌进行抑菌效果测定,并建立毒力回归方程;筛选出有效的抑菌药剂,为防治该病的发生提供理论依据。【结果】从不同病斑上分离出了3个纯化菌株,其形态特征相同。通过病原菌rDNA-ITS克隆测序、比对分析,3个菌株为同一致病菌,应用BLASTn比对结合形态学特征确定该致病菌为链格孢（Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissler）。在10 μg•mL-1含药PDA平板上,7种杀菌剂对链格孢菌菌株的抑菌率均大于80%,分别为400 g•L-1氟硅唑、500 g•L-1异菌脲、80%戊唑醇、10%多抗霉素B、12.5%烯唑醇、33.5%喹啉酮和10%苯醚甲环唑。【结论】确定中华猕猴桃褐斑病由链格孢引起,400 g•L-1氟硅唑、500 g•L-1异菌脲、10%多抗霉素B和10%苯醚甲环唑对链格孢抑菌效果较强。     

诺氟沙星ELISA试剂盒研制与性能鉴定

【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin,Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit）,并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1,灵敏度为0.31 μg•L-1,检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异系数也小于10%;在4℃保存条件下,试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验,试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）;而且检测实际生产中鲜奶样时,试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。     

非变性原位杂交技术在芝麻染色体识别上的探索与应用

【目的】研究和确定芝麻ND-FISH最优试验条件,并对其在芝麻染色体识别中的可行性进行探索。【方法】以寡聚核苷酸(AC)8为探针,研究不同洗脱强度、酶解时间和杂交时间对ND-FISH的影响,确定芝麻ND-FISH最优试验方案。【结果】芝麻ND-FISH最优方案：制片在浓度100 μg•mL-1 RNase A酶解1 h,探针浓度6 µL（20 ng•µL-1）,杂交4 h,4 × SSC/0.2% Tween 20溶液洗脱10 min;18条染色体存在(AC)8杂交信号,其中,14条染色体上存在较强杂交信号,4条染色体上有较弱杂交信号,结合染色体长度及臂比,18条染色体可有效识别。【结论】利用ND-FISH技术、以(AC)8为探针成功识别栽培芝麻的18条染色体。     

苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

苦马豆素抗牛病毒性腹泻病毒的研究

【目的】疯草是中国西部影响草地生态和畜牧业健康发展的毒草之一。主要有豆科棘豆属和黄芪属有毒植物等,在冬季牧草严重缺乏的时节,牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生产性能下降,甚至死亡,每年给我国草地生态和畜牧业造成的直接经济损失达几十亿元,是危害最严重的毒草。目前,我国西部天然草地动物因疯草中毒死亡所造成的经济损失仍持续剧增。苦马豆素被认为是引起动物疯草中毒的主要毒性成分。由于疯草分布广泛,资源丰富,如何改善草地生态,合理开发利用疯草成为研究的课题和方向。近几十年来, 随着对疯草研究的深入和扩展,人们发现苦马豆素不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可作为免疫调节剂、抗HIV及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用。目前,国内在对苦马豆素抗肿瘤、调节机体免疫方面研究较热,但是,对苦马豆素在抗病毒活性、作用机理方面的研究尚无相关报道。为了探讨茎直黄芪中生物碱苦马豆素（swainsonine,SW）抗牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗BVDV的药物筛选提供参考依据。【方法】利用细胞培养技术,采用CPE观察法和MTT比色法相结合的方法测定不同浓度SW对牛肾原代细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,确定药物的安全浓度和TD50,并分别采用先加药后感染病毒、先感染病毒后加药、药毒作用2 h后加入、感染病毒同时给药后再加药四种作用方式,检测不同浓度SW对BVDV入侵的阻断作用、复制的抑制作用、直接杀伤作用和综合作用,并计算不同作用方式下的治疗指数。【结果】结果显示：SW浓度小于0.256 μg•mL-1范围内对MBDK细胞无毒性作用,在大于0.512 μg•mL-1浓度下MBDK细胞表现出一定程度的病变,TD50为2.512 μg•mL-1,按Reed-Muench 氏法计算BVDV TCID50为10-4.7/0.1mL;在体外随苦马豆素质量浓度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效关系,且与作用方式有关,比较四种作用方式下的治疗指数1.05、2.47、2.08和3.21,说明SW对BVDV的综合作用（65.29%,P＜0.01）和复制（65.05%,P＜0.01）的抑制作用较好,亦有一定的直接杀伤作用,但对其入侵的阻断作用不佳。【结论】SW在体外有良好抗BVDV活性作用,并推测苦马豆素（SW）抗病毒的主要效应可能是SW能进入细胞内抑制BVDV的复制增殖以及直接灭活游离BVDV而发挥作用。     

FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和 cyclin E1 mRNA表达的影响

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR 检测cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH（0—100 ng•mL-1）均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在FSH浓度为50 ng•mL-1时两种基因的表达量最大（P＜0.05）;FSH（50 ng•mL-1）也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在作用30 min时其表达量达到高峰（P＜0.05）。不同浓度的Foskolin （0—20 μmol•L-1）均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP（0—40 μmol•L-1）、H-89（0—30 μmol•L-1）和Verapamil（0—100 μg•mL-1）以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果（P＜0.05）,但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126（0—10 μmol•L-1）降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显著差异（P＞0.05）。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

响应面优化苹果皮渣多酚超声提取工艺研究

【目的】研究超声波辅助乙醇提取苹果皮渣多酚的最佳工艺条件。【方法】以工厂榨汁后的苹果皮渣为原料,在单因素试验的基础上,选取提取时间、超声功率、提取温度、料液比为自变量,多酚的提取率为响应值,根据响应面Box-Benhnken试验设计原理,采用四因子三水平的分析法模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,优化苹果皮渣多酚超声提取工艺。【结果】回归模型具有高度显著性,方程对试验拟合较好,可以对苹果皮渣多酚得率进行很好的分析和预测;各因子对提取率的影响大小依次是提取温度＞料液比＞提取功率＞提取时间;响应面分析图表明提取时间和超声功率交互作用不显著,提取温度和超声功率交互作用极显著,料液比的主效应大于温度;超声波辅助乙醇提取苹果皮渣的最佳工艺条件为超声时间10 min,提取温度65℃,超声功率503 W,料液比1﹕30。【结论】多酚的提取率达4.53 mg•g-1,与预测值4.55 mg•g-1基本一致。