基因敲除GCV2的酿酒酵母构建

[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。     

酿酒酵母菌关键酶基因剔除对谷胱甘肽合成的影响

[目的]通过基因工程手段改良酿酒酵母菌以提高谷胱甘肽的产量。[方法]利用基因重组技术分别构建CYS3基因剔除菌和CYS4基因剔除菌,对比了野生菌与突变酵母菌的生长曲线,并定量检测2者中谷胱甘肽和氨基酸的含量,得出CYS3基因和CYS4基因剔除对谷胱甘肽和氨基酸代谢的影响程度。[结果]与野生菌株相比,CYS3基因剔除菌中谷胱甘肽含量降低了26.1%,CYS4基因剔除菌中谷胱甘肽含量提高了6.0%。[结论]综合CYS3和CYS4基因剔除和其他在谷胱甘肽代谢途径中关键酶基因剔除试验结果所得数据,可以建立酿酒酵母谷胱甘肽代谢网络系统生物学模型。     

1株假单胞菌oprD基因缺失和回补载体的构建

[目的]构建假单胞菌毒性基因(oprD)缺失突变株,为进一步探讨其编码的毒力因子功能奠定基础。[方法]利用pEX18Gm质粒作为基因敲除的载体,构建假单胞菌oprD基因重组自杀质粒,通过同源重组并激活自杀基因方式,筛选到目的基因缺失的突变株,再利用pBBR1MCS-2质粒作为目的基因回补的载体,构建回补载体。[结果]同源重组后,经过庆大霉素和氯霉素双抗平板、蔗糖平板筛选和PCR鉴定,成功获得了oprD基因缺失突变株,类似操作获得了回补菌株。[结论]基因缺失突变株的成功构建可为下一步的毒性机理研究奠定基础。     

超氧化物歧化酶在酿酒酵母碱胁迫抗性中的功能研究

[目的]研究酿酒酵母超氧化物歧化酶与其碱胁迫抗性的相关性。[方法]采用可见分光光度法,测定碱胁迫条件下酵母菌超氧化物歧化酶活性（SOD）指标;采用平板滴定生长试验,检测酿酒酵母铜/锌超氧化物歧化酶缺失菌株（sod1Δ）和锰超氧化物歧化酶缺失菌株（sod2Δ）的碱胁迫抗性;采用台盼蓝染色,检测碱胁迫条件下酵母细胞的存活率。[结果]在pH值为7.9条件下处理2h可明显诱导酵母细胞内SOD活性升高;与野生型酵母菌株相比,sod1Δ和sod2Δ基因缺失菌均表现碱胁迫敏感表型,并且碱胁迫条件下细胞存活率明显下降。[结论]超氧化物歧化酶在调控酿酒酵母碱胁迫抗性中发挥重要作用。     

酵母CFD1基因缺失菌株构建及其对复制寿命的影响

目的测定CFD1基因缺失对酿酒酵母复制寿命的影响。方法运用基因同源重组技术构建单基因缺失酵母菌株,利用光学显微镜检测酵母细胞的复制寿命。结果与野生型酵母菌株（29.29±8.71代对比,CFD1基因缺失酵母菌株复制寿命（27.27±8.01）代有所变短,但差异无统计学意义。结论 CFD1基因缺失不影响酿酒酵母的复制寿命。）     

UPEC双组分信号系统KguS/KguR调控基因缺失株的构建及其生长特性研究

[目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC) CFT073株的双组分信号系统Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032—c5037基因同源臂的氯霉素抗性基因取代c5032—c5037基因,在温度敏感型质粒p CP20作用下消除氯霉素抗性基因,构建基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,用PCR和基因测序验证基因敲除是否成功,测定有氧和厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养不同时间的菌液D600值。[结果]构建了CFT073Δc5032—c5037,PCR验证及基因测序结果均表明已成功敲除c5032—c5037基因;厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中生长比野生型菌株CFT073缓慢,且差异极显著(P0.01),但在有氧条件下二者的生长无显著差异。[结论]成功构建了基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,并试验证实Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因在厌氧条件下参与α-酮戊二酸的利用,为进一步研究Kgu S/KguR在UPEC中的代谢适应机制奠定了基础。     

酿酒酵母 ERG6基因缺失突变株的构建

设计含有与ERG6基因两侧序列同源的长引物,以质粒pBlue-Kan为模板进行PCR扩增,构建含有Cre/lox P系统的酿酒酵母ERG6基因敲除组件.将基因敲除组件转化至酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)AD1-8,通过同源重组的方式使目的基因缺失,获得为lox P-Kan-lox P序列组件所替换而产生Kanr的阳性克隆子.然后再将质粒pHis-Cre转入阳性克隆子表达Cre重组酶敲除筛选标记,成功获得酿酒酵母ERG6基因缺失的突变株,并命名为AD1-8-δ.     

紫苏PfDGAT1酵母功能互补分析

[目的]本试验将已克隆的紫苏种子中高表达二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因PfDGAT1转化至酿酒酵母突变型菌株H1246进行酵母互补功能验证,研究二酰甘油酰基转移酶是否具有催化油脂合成的作用。[方法]通过构建紫苏DGAT基因的酵母表达载体pYES2.0-PfDGAT1并转化至酿酒酵母突变型菌株H1246,用尼罗红对转基因酵母细胞染色,检测转基因酵母中是否能合成油体;利用薄层层析(TLC)试验检测转基因酵母中是否存在三酰甘油(TAG)。[结果]转pYES2.0-PfDGAT1载体的突变型酵母菌株H1246能够检测到有油体存在,而转pYES2.0空载体的突变型酵母菌株H1246中没有检测到油体,说明紫苏PfDGAT1基因的表达恢复了酿酒酵母突变型菌株H1246油体缺陷的表型,可以催化TAG合成。[结论]PfDGAT1基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,该研究结果为深入解析PfDGAT1基因在紫苏油脂合成途径中的功能奠定了基础。     

类黄酮异戊烯转移酶基因在酿酒酵母中的表达

[目的]对类黄酮异戊烯转移酶基因在酿酒酵母中的表达进行研究。[方法]以粗毛淫羊藿为材料,对其类黄酮异戊烯转移酶基因(EaPT1)进行克隆,并构建重组质粒,将其转化至酿酒酵母INVSc1中表达,进行黄酮类底物粗酶检测。[结果]获得了大小约1 200 bp的EaPT1基因;经SDS-PAGE检测,重组质粒转化后的酵母菌有疑似EaPT1的表达产物;粗酶检测中未能检测到EaPT1酶活性。[结论]为粗毛淫羊藿植物次生代谢,特别是类黄酮生物合成途径的解析奠定基础。     

一种新的大丽轮枝菌基因敲除载体的构建

[目的]研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建一个便于筛选敲除转化子的高效基因敲除载体.[方法]通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因(GFP),连接到pMD18-T载体上,测序验证,利用限制性内切酶HindⅢ将目的片段切下,连接到敲除载体pRF-HU2的多克隆位点上.通过电击转化法将载体转化到农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导法(ATMT)转化到大丽轮枝菌.[结果]成功得到一种新的携带GFP筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体,通过GFP基因的筛选,T-DNA随机插入转化子在荧光显微镜下呈现绿色,相反敲除转化子在荧光显微镜下不呈现绿色.[结论]构建了一种大丽轮枝菌基因新的高效敲除载体,利用该载体大大节省了筛选转化子所用的时间,为大丽轮枝菌功能基因的验证提供了技术平台.     

酿酒酵母与甘氨酸发酵生成甲醇关系的研究

[目的]研究确定甘氨酸与酿酒酵母生成甲醇的数量关系。[方法]采用高效液相色谱法测定发酵液中甘氨酸含量和顶空气相色谱法测定酒中甲醇含量。[结果]发酵液中甘氨酸浓度在0～0.9 g/L范围内与酿酒酵母生成甲醇的量成线性关系,线性方程:Y=103.3X-4.5。[结论]确定了发酵液中甘氨酸与酿酒酵母生成甲醇的对应关系。     

高产酒精的番茄酿酒酵母的选育研究

[目的]筛选出产酒能力高、发酵速度快的番茄酿酒酵母突变株。[方法]以从番茄表面分离筛选的产酒酵母HBF-2为出发菌株,分别利用紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)进行诱变,通过测定吸光度和致死率绘制出发菌株的生长曲线与致死曲线,根据诱变后菌落形态特征对菌种初筛,根据发酵酒的酒精度、残糖和总酸检测对菌种进行复筛,并对目的菌株进行遗传稳定性试验。[结果]研究表明,出发菌株HBF-2生长周期为24 h,培养10 h后进入对数生长期;利用20 W紫外灯,在照射距离为40 cm条件下,照射时间为90 s,筛选出产酒能力比HBF-2提高了18.2%的突变株UV-8;UV-8连续传代5次,番茄发酵试验结果显示该菌株有良好的遗传稳定性。[结论]研究可为番茄酒的酵母选育提供理论基础与参考。     

原生质体融合法选育酵母菌株酿造低甲醇高总酯蒸馏酒

[目的]选育酿造低甲醇高总酯蒸馏酒的酿酒酵母菌株.[方法]利用原生质体融合技术,对低甲醇酿酒酵母与高总酯酿酒酵母进行融合.[结果]选育出的酵母菌种酿造蒸馏酒中的相对甲醇含量为145.31 mg/L,比初始低甲醇菌株降低了22.8％,总酯含量为0.79g／L,增加了83.7％.[结论]原生质体融合法成功选育出低甲醇高总酯的酿酒酵母菌株.     

酒精耐受型酿酒酵母菌的诱变筛选

[目的]筛选酒精耐受型酿酒酵母菌最佳菌株。[方法]利用紫外线对酿酒酵母JL2008进行诱变处理,并结合氯化三苯四氮唑(TTC)进行筛选,对5株对酒精具有较强耐受性的突变株SC1～SC5的酒精耐受性进行比较,选择出2株酒精耐受性较强的突变株(SC1和SC5)进行酒精发酵,测定其生长速率和发酵性能。[结果]2株菌的酒精耐受能力远远高于出发菌株,均能在酒精体积分数为9%的培养基上生长;在含糖15%的培养基中,SC1的酒精发酵终浓度和发酵效率与原始菌株大致相同;在含糖30%的培养基中,SC1的酒精发酵终浓度和发酵效率分别是16.54%和85.2%,均高于原始菌株。[结论]突变株SC1在含酒精培养基中的生长和在浓醪条件下的发酵效果优于JL2008,是一株极具潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

沙田柚果酒酿造工艺研究

[目的]研究沙田柚果酒的酿造工艺。[方法]以沙田柚为原料,选用ZHK-I葡萄酒酵母作为发酵菌种进行发酵酿造沙田柚果酒,对果胶酶酶解、果汁脱苦、发酵工艺及果酒澄清等工艺进行研究,确定最佳工艺参数。[结果]果胶酶水解的最佳条件为：温度45℃、酶添加量0.02%、酶解时间100min、pH值3.5;果汁脱苦最佳条件为：β-环糊精的添加量0.8%、β-环糊精作用时间60min;酒精发酵的最优条件为：发酵温度30℃、接种量6%、SO2添加量50mg/L、pH值4.2;壳聚糖添加量为0.06%时,澄清效果较佳,透光率可达94.5%。[结论]酿制出来的沙田柚果酒澄清透亮,酒味浓郁,同时具有沙田柚的特殊清香味。     

橡实制备燃料乙醇菌种筛选及工艺考察

[目的]筛选适宜的橡实制备燃料乙醇的菌种,并优化该发酵工艺。[方法]以橡实粉为原料,筛选适宜的燃料乙醇发酵菌株,并对该工艺条件进行了优化。[结果]酿酒酵母FE-B是一株高效的耐受单宁中温菌株。以橡实粉制备燃料乙醇,当液化温度为95℃,乳液浓度为32%,液化pH为5.8,液化酶用量0.06%,糖化酶用量0.05%,发酵温度为36℃时,可获得较高产率的燃料乙醇。[结论]在纤维乙醇生产技术尚不成熟的前提条件下,为了发展非粮燃料乙醇,利用野生淀粉资源橡实发酵生产燃料乙醇是一种很好的选择。     

高产谷胱甘肽酵母菌株的筛选和抗乙硫氨酸突变株的选育

[目的]选育高产谷胱甘肽的酵母菌株。[方法]通过紫外线进行诱变处理,运用推理育种技术获得抗乙硫氨酸突变株。[结果]从土壤中筛选出一株高产GSH的菌株HSJB1,其摇瓶发酵生物量为3.87 g/L,GSH产量为91.87 mg/L。依据菌株的细胞形态特征及生理生化特征,初步鉴定其为Saccharomyces cerevisiae。通过紫外线对出发菌株HSJB1进行诱变处理,获得一株抗乙硫氨酸突变株YBS77,该突变株经摇瓶发酵,生物量达7.60 g/L,GSH产量为211.96 mg/L。[结论]通过选育获得的突变株生物量比出发菌株提高了96.38%,GSH产量提高了130.72%,表明该育种方法可行。     

酿酒酵母和异常汉逊酵母在酿酒过程中的相互作用

[目的]探究酿酒酵母与异常汉逊酵母在半固态白酒酿造过程中的相互作用。[方法]在白酒酿造过程中,通过对微生物纯培养和混合培养过程中微生物数目变化、理化指标变化来探究酿酒酵母与异常汉逊酵母间的相互作用。[结果]在酿酒酵母、异常汉逊酵母共培养过程中,异常汉逊酵母经过24 h短暂生长后迅速衰亡;对可能引起异常汉逊酵母衰亡的因子包括碳源、酒精度、p H、酵母无细胞滤液的初步研究,发现在酿酒酵母无细胞滤液和混合酵母无细胞滤液中,异常汉逊酵母生长受到明显抑制而酿酒酵母生长正常。[结论]异常汉逊酵母和酿酒酵母共培养时,异常汉逊酵母的生长受到明显抑制,酿酒酵母的代谢产物是抑制其生长的主要原因。