巴西橡胶树核糖体蛋白S6基因的克隆及生物信息学分析

核糖体蛋白S6是核糖体蛋白家族的重要成员,在核糖体中发挥重要作用。利用农业部橡胶生物学重点开放实验室获得的部分序列设计引物,采用3-′RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得一个核糖体蛋白S6基因的完整阅读框,该基因编码249个氨基酸的多肽,含有一个典型的真核生物核糖体蛋白S6结构域。在HbRPS6氨基酸序列中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明：HbRPS6属于混合型蛋白。对10个RPS6系统进化分析表明：巴西橡胶树的RPS6基因在进化上具有保守性,与植物类玉米的RPS5基因亲缘关系最近,而与动物和酵母的亲缘关系相对较远。该基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。     

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。     

巴西橡胶树MADS-27基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树花芽为材料,利用RT—PCR技术从总RNA中扩增获得1个MADS基因。eDNA长度1063bp．开放阅读框717bp,编码239个氨基酸．命名为HbMADS-27。在HbMADS-27氨基酸序列中具有1个较强的跨膜区,二级结构分析结果表明其属于混合型蛋白。HbMADS-27在N端前34-50氨基酸区域内为较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对20个MADS蛋白进行系统进化分析,结果发现,巴西橡胶树的HbMADS-27基因与蓖麻的MADS-27基因亲缘关系最近,而与拟南芥MADS-27基因亲缘关系相对较远。     

大熊猫核糖体蛋白S17亚基基因（rps17）的克隆及序列分析

RPS17蛋白是核糖体40S亚基的组成部分,由rps17基因编码.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps17基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基rps17基因的异同,分别运用RT-PCR和PCR技术,从大熊猫肌肉组织的mRNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基S17基因的cDNA序列以及从总DNA中成功克隆了S17基因的结构基因序列.序列分析发现,大熊猫核糖体蛋白亚基S17基因的表达序列长为457bp,开放阅读框(ORF)为408bp,编码135个氨基酸的蛋白质.结构基因序列长2 368bp,含有4个外显子和3个内含子.拓扑预测显示,核糖体蛋白亚基RPS17的相对分子质量为15.52×103,PI为10.26,含有5个类型的功能位点,即:5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个N-豆蔻酰化位点及1个核糖体蛋白S17Esignature位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性,其蛋白质的高级结构除褐家鼠外与其它物种也具有一致性.对大熊猫rps17基因及其表达的蛋白质结构的比较研究,旨在丰富和完善哺乳动物r...     

枣60S核糖体蛋白L8-3基因的克隆及生物信息学分析

核糖体是细胞进行蛋白质合成的重要场所。为了解枣60S核糖体蛋白L8-3基因的结构,以‘月光’枣为材料,根据GenBank中登录的苹果、桃和柑橘等植物60S核糖体蛋白保守序列设计引物,采用RT-PCR法,从枣叶片中克隆出该基因,并对其编码蛋白进行了生物信息学分析。生物信息学分析表明:该基因包含完整的开放阅读框为783bp,编码260个氨基酸残基,预测分子量为28.025kDa,理论等电点为10.83,命名为ZjRPL8-3(登录号:KM106202);保守结构域分析表明,该序列属于L2超家族蛋白;分子进化树显示,枣ZjRPL8-3与蔷薇科植物中该基因的蛋白序列亲缘关系最近,此结果一定程度上反应了物种间的亲缘关系。     

巴西橡胶树β-木糖苷酶基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树根为材料,利用RT-PCR技术从总RNA中捕获到一个β-木糖苷酶家族基因(β-xylosidase或β-D-xyloside xylohydrolase,EC 3.2.1.37),cDNA长度2 880 bp,开放阅读框2 319 bp,编码773个氨基酸,命名为HbEC32。在HbEC32氨基酸序列中具有一个较强的跨膜区,二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbEC32在N端前8~20氨基酸区域内为较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对15个β-木糖苷酶蛋白进行系统进化分析发现,巴西橡胶树的HbEC32基因与蓖麻亲缘关系最近。     

松墨天牛核糖体蛋白（RPS15A）cDNA的克隆及农药胁迫对其表达的影响

【目的】研究不同类型农药胁迫下松墨天牛核糖体蛋白基因表达的变化,为靶标防治松树重要害虫松墨天牛提供理论依据和参考。【方法】从构建的松墨天牛cDNA文库中获得表达序列标签(EST),用Blast程序从GenBank数据库中查找同源序列,克隆得到松墨天牛的一个核糖体蛋白基因;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测11种农药胁迫下该基因的表达。【结果】从松墨天牛cDNA文库中获得1条EST序列与昆虫核糖体蛋白S15A(RPS15A)同源的基因,命名为MaRPS15A。MaRPS15AcDNA长504bp,含有5′、3′非编码区和长393bp的开放阅读框,编码130个氨基酸,预测的蛋白质分子质量为14.75ku,理论等电点为9.95。MaRPS15A与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)核糖体蛋白RPS15A的相似性为98%,与其他昆虫核糖体蛋白RPS15A的相似性大于88%。除溴氰菊酯外,其他农药胁迫导致MaRPS15A相对表达量下降。【结论】成功克隆了松墨天牛核糖体蛋白基因MaRPS15A(GenBank登录号:KJ930032)。大多数农药抑制了MaRPS15A的表达,表明松墨天牛受到了不利影响。     

巴西橡胶NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

[目的]探讨巴西橡胶NBS类抗病基因同源序列的克隆与序列分析。[方法]以高抗炭疽病的巴西橡胶无性系R042为材料,根据抗病基因Prf、L6、N等的P．100p和GLPL保守结构域设计简并引物,从R042扩增具有抗病基因同源序列的片段,对分离获得的抗病基因同源序列进行Blastn、氨基酸同源性分析、序列比较和系统进化分析。[结果]从巴西橡胶高抗炭疽病无性系R042基因组DNA中分离获得1个NBS类抗病基因同源序列,经Blastn比对后发现,该抗病基因同源序列与毛果杨中的一个CC—NBS—LRR抗病蛋白的mRNA的序列同源性为66％,Blastn的E值为2e-24,推测氨基酸序列与已知抗病基因的相似性在26．9％～43．2％。[结论]序列比对与系统进化分析表明,该抗病基因同源序列具有NBS类抗病基因的所有保守序列,且与Xal的亲缘关系最近。     

巴西橡胶树线粒体50S核糖体蛋白L21 cDNA的克隆与分析(英文)

[目的]在橡胶生产中,一种叫做"死皮"的生理综合症严重制约了橡胶树(Hevea brasiliensis)单产的提高。为揭示橡胶树"死皮"发生的分子机理,研究对一差异表达的HbmRPL21进行了克隆,并在此基础上对其进行深入的生物信息学分析。[方法]在早期构建的差减文库中,筛选到一条在死皮植株中下调表达的基因片段,该片段编码的蛋白与线粒体50S核糖体蛋白L21(mRPL21)同源。通过ESTs序列拼接和RT-PCR,获得一条853bp的cDNA序列(命名为HbmRPL21,GenBank登录号为HM800425),该序列包含一个完整的开放读码框。[结果]信息分析表明,HbmRPL21编码271个氨基酸,理论分子量为30.52kD,等电点为8.40,HbmRPL21是一个包含Ribosomal_L21p保守结构域的线粒体定位蛋白。进化分析表明,植物和动物界间mRPL21序列差异很大,而植物界内则相对比较保守。[结论]研究为下一步阐明HbmRPL21在橡胶树"死皮"中的生物学功能奠定了理论基础。     

小麦条锈菌泛肽-核糖体蛋白S27a基因的鉴定与表达分析

从小麦条锈菌吸器cDNA文库中鉴定到一个泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)基因,命名为PsUBRS27a。该基因开放阅读框为480bp,编码包含159个氨基酸残基的蛋白质,其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin和Ribosomal_S27结构域;序列比对发现UBRS27a蛋白在不同物种中高度保守,但PsUBRS27a蛋白在进化上与柄锈菌属的UBRS27a蛋白亲缘关系最近;种内多态性分析发现PsUBRS27a基因在不同小麦条锈菌菌系中的序列非常保守,无核苷酸变化;实时荧光定量PCR结果表明,PsUBRS27a基因在条锈菌侵染小麦过程中呈上调表达趋势,高峰期为接种后168h。     

低氧胁迫下斑马鱼鳃中核糖体蛋白基因家族的表达分析

为研究斑马鱼核糖体蛋白应对低氧胁迫的生物学功能，对低氧胁迫和常氧条件下斑马鱼（Danio rerio）鳃组织进行转录组分析，利用高通量测序检测了低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃转录组中核糖体蛋白家族基因的表达差异。结果表明：在两个不同浓度的低氧胁迫下，斑马鱼鳃组织中60个核糖体蛋白基因的表达量显著上调。其中大亚基核糖体蛋白基因35个，小亚基核糖体蛋白基因25个。在低氧胁迫下斑马鱼鳃中显著差异表达基因GO富集的前15条通路中，均包括核糖体蛋白基因，且其中的5条通路与核糖体蛋白组装合成相关。在富集到“translation”GO通路中，富集到44个核糖体蛋白基因。另外，利用前期筛选出的低氧条件下斑马鱼鳃中显著低表达的2个miRNAs，针对低氧下表达量显著上调的60个核糖体蛋白基因进行靶基因预测，结果表明：斑马鱼miR-455-3p可以同时靶向核糖体蛋白基因rpl13和rplp1来调控斑马鱼对低氧环境的适应。     

Crystal structure of the eukaryotic 40S ribosomal subunit in complex with initiation factor 1

Eukaryotic ribosomes are substantially larger and more complex than their bacterial counterparts. Although their core function is conserved, bacterial and eukaryotic protein synthesis differ considerably at the level of initiation. The eukaryotic small ribosomal subunit (40S) plays a central role in this process; it binds initiation factors that facilitate scanning of messenger RNAs and initiation of protein synthesis. We have determined the crystal structure of the Tetrahymena thermophila 40S ribosomal subunit in complex with eukaryotic initiation factor 1 (eIF1) at a resolution of 3.9 angstroms. The structure reveals the fold of the entire 18S ribosomal RNA and of all ribosomal proteins of the 40S subunit, and defines the interactions with eIF1. It provides insights into the eukaryotic-specific aspects of protein synthesis, including the function of eIF1 as well as signaling and regulation mediated by the ribosomal proteins RACK1 and rpS6e.     

蛋白激发子产生菌链格孢(Alternaria spp.)JH505菌株分子系统学研究

在传统真菌形态学分类研究的基础上,运用遗传学、分子生物学研究手段,结合生物信息学方法对具有诱导植物增产抗病的蛋白激发子产生菌链格孢(Alternaria spp.)JH505菌株进行了分子系统学研究.克隆了该菌株长度为1 267bp的rDNA序列.结果表明,rDNA包含部分18S rRNA、28S rRNA序列及完整的5.8S rRNA、转录外间隔区(ITS1、ITS2)rRNA序列,与A.tenuissima、A.cinerariae、A.dianthi、A.brassicae、A.zinniae相应的rDNA分别具有100%、98%、97%、97%和96%的相似性.结合菌落形态、孢子特征以及rDNA分析.鉴定该菌株为细极链格孢菌(A.tenuissima).     

人核糖体40S亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,属于核糖体蛋白S17p家族,由RPS11基因所编码,主要存在于真核生物中。本研究通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,序列测定正确后,将其转入E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE分析后,利用亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆RPS11基因,构建了原核表达载体pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE分析证实表达目的蛋白正确。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析柱获得纯化蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

改良RACE技术克隆板栗短雄花序26S核糖体基因片段

RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术是以RT-PCR为基础,根据部分已知基因序列(如EST),通过cDNA的3′端和5′端快速扩增获取全长cDNA的一种有效方法。本文作者以板栗芽变品种短雄花序为材料,利用改良SMART RACE的技术克隆了板栗(Castanea mollissimaBlume)26S基因5′端未知序列,所得到的cDNA的5′末端共有1 204 bp。序列比对分析显示,该检测的核糖体基因与已知其他物种中的核糖体基因高度同源,它与已克隆到的同源基因橡树和八角枫之间的同源性分别为98%和97%。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)SWP2基因的克隆、表达及其在虾类病害检测中的应用

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是虾类养殖过程中一种非常重要的病原微生物。目前常用的EHP检测方法是以核糖体18S基因为靶基因的PCR检测,但由于18S基因的高度保守性,该方法存在一定的非特异性扩增问题。本研究利用电子克隆方法,得到了特异性较高的EHP孢壁蛋白2(spore wall protein 2,SWP2)基因。该基因的cDNA全长为1 019 bp,开放阅读框全长687 bp,编码229个氨基酸,预测相对分子质量为26.32 ku,5'非编码区为120 bp,3'非编码区为179 bp,系统进化分析表明与毕氏肠孢虫和绒螯蟹肠孢虫具有较近的亲缘关系。构建了重组表达载体pET15b-SWP2,利用原核表达得到SWP2蛋白,相对分子质量约为28 ku,并制备了该蛋白的单克隆抗体。采用常规PCR及Western blot方法对市售的商品虾进行了EHP感染情况检测,结果显示,两种方法均能准确地进行检测分析。本研究结果为虾农肝肠微孢子虫病的诊断提供了技术支撑,同时为SWP2蛋白功能的研究打下了基础。     

Erythromycin Resistance of Streptococcus suis Isolates In Vivo

In order to study erythromycin resistance of Streptococcus suis under high or low concentration of selective drug pressure, Streptococcus suis strain LN was isolated from a diseased pig in 2005 and showed to be susceptible to erythromycin as determined by disc diffusion and tube dilution tests. In this study, clean level rabbits were divided into three groups of six rabbits each, including a prevention dosage group, a treatment dosage group, and a control group. After injection with S. suis strain LN, erythromycin （20 μg mL^-1） was taken orally in the prevention dosage group, erythromycin （5 mg kg^-1） was injected intramuscularly in the treatment dosage group, and no treatment was given in the control group. S. suis with intermediate resistance to erythromycin was isolated on the 5th day after infection from the prevention dosage group （5th PDG） and on the 7th day after infection from the treatment dosage group （7th TDG）. Both isolates were determined to be the constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B （cMLSB） resistance phenotype. The resistance gene ermB was detected in all of the isolates. The results suggested that both the 5th PDG and 7th TDG isolates had a mutation （A2372T） in the 23S rRNA gene. In addition, the 5th PDG isolates had a mutation in ribosomal protein L4 （detected as G268A） and a mutation in ribosomal protein L22 （A345C）; and the 7th TDG isolates had a C insertion at site 564. Each of these mutations is considered as a possible mechanism of erythromycin resistance in S. suis strain LN. This study demonstrated that erythromycin resistance was readily induced in S. suis at a low erythromycin dose creating selective pressure in vivo. Resistance appeared to be mediated by ribosome methylation, encoded by the ermB gene.     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。