2株重寄生菌的分离和对靶标菌的抑制作用

用选择性培养基和诱捕分离法获得温室番茄叶片上发生的重寄生菌F46，从被条锈菌感染的小麦叶片上分离获得重寄生菌PR。本研究从形态特征、培养特征、生理生化特性等方面对2种重寄生菌进行了初步鉴定，F46属于链霉菌（Streptomtyces sp.）金色类群；PR归属于链霉菌（Streptomyces sp.）轮生类群。F46和PR对除禾顶囊壳以外的其他8种供试靶标病原真菌（胶孢炭疽病、灰葡萄孢、大丽轮枝菌、尖孢镰孢萎蔫专化型、褐孢霉、粉红聚端孢、梨状毛霉、扩展青霉）具有不同的抑制作用，对梨状毛霉的抑制效果最好；PR对所有致病菌的作用优于F46。40％五氯硝基苯、50％腐霉利和链霉素对2种重寄生主菌均无抑制作用。F46对70％代森锰锌和25％甲霜灵都非常敏感，PR仅对50％多菌灵非常敏感。     

重寄生链霉菌F46与链霉菌SC1融合子的筛选

运用原生质体融合技术将重寄生链霉菌F46与生防链霉菌SC1融合,获得40株融合子.依据形态特征、皿内拮抗试验对获得的融合子进行初筛,发酵液抑菌活性测定,筛选出2株抑制效果明显的融合子FSf-11和FSf-13.皿内拮抗试验结果表明,2个融合子对灰葡萄孢(B.cinerea)有明显的抑制作用,抑制率比亲本SC1分别提高了27.99%和20.56%,镜检发现灰葡萄孢的基内菌丝畸形,经FSf-13处理后还出现原生质凝聚现象.融合子的发酵滤液对胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)抑制效果显著,抑菌圈直径超过了20 mm;融合子FSf-11的发酵滤液对尖镰孢萎蔫专化型(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)和大丽轮枝菌(V.dahliae)的孢子萌发抑制作用最强,其孢子萌发率低于10%;融合子FSf-13对2种靶标菌的孢子萌发抑制率也超过了50%.     

大丽轮枝孢和灰葡萄孢生防放线菌的分离筛选

采用诱捕分离法从土壤中分离到28株放线菌,以大丽轮枝孢(Verticillium dahliae)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)作为靶标菌,通过皿内拮抗试验从中筛选出效果明显的SW6,SW9,SW16,SW20 4株生防菌株,其发酵原液对靶标菌的抑制效果明显高于发酵滤液和菌丝初提液。其中,菌株SW20的发酵液对2种靶标菌均有较强的抑制作用。抗药性测定结果表明,4株生防菌株对链霉素最为敏感,对供试杀菌剂抗性较强。     

诱捕分离土壤中的生防放线菌

以灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和黄枝孢(Fulviafulva)2种病原真菌作为靶标菌,利用皿内诱捕法从土壤中分离获得22株放线菌,经对7种靶标真菌进行皿内拮抗性测定结果表明,其中8株放线菌对部分病原真菌有很强抑制作用,占到分离菌株总数的47.1%,有较强抑制作用的放线菌有7株。有45%的菌株可以抑制苹果炭疽菌、茄子黄萎菌和大豆腐霉菌。菌株SC1,SC11和A1的发酵液对4种靶标菌的抑制作用最强,75%菌株的发酵液对灰葡萄孢有较强的抑制作用,菌株SC1,SF1和A3的发酵液对苹果灰葡萄孢的控制作用超过80%。     

5株放线菌对9种靶标病原真菌的持续抑菌作用

测定了采用“诱捕分离”法获得SC1,SC11,A3,A4和SE25株放线菌的皿内抑菌活性,对受抑菌丝进行了显微观察,在此基础上,研究了5株放线菌对9种靶标真菌的持续抑菌作用。结果表明,放线菌A3菌株对灰葡萄孢菌和立枯丝核菌、菌株A4对梨状毛霉菌和立枯丝核菌以及菌株SE2对灰葡萄孢菌、梨状毛霉菌和立枯丝核菌均表现出显著的抑菌活性,抑菌率均大于80％;经放线菌处理后,靶标真菌的基内菌丝不同程度地发生了畸变,随着处理时间的延长畸变程度升高;5株放线菌对供试的靶标真菌均不同程度地表现出持续抑菌作用,同一放线菌的持续抑菌作用谱不同,同一靶标真菌被持续抑制的放线菌种类和数量也不同,菌株SC1,A3和A4表现的持续抑菌作用最强。     

番茄内生放线菌ts-6及其次生代谢产物对番茄灰霉病的防病效果

测定了番茄内生放线菌ts-6对灰葡萄孢菌的拮抗作用及其防病效果,结果表明:对峙培养时ts-6菌株对灰葡萄孢菌菌丝生长有明显的拮抗作用,培养7d后可形成直径30mm的抑菌圈,抑菌带宽度达12mm。显微镜下可见抑菌圈边缘菌丝体畸形膨大,分隔、分枝增多,部分菌丝顶端膨大呈泡囊状,有的泡囊破裂、原生质外泄t。s-6菌株胞外分泌物对灰葡萄孢菌孢子萌发和菌丝生长的抑制试验说明,其胞外分泌的拮抗物质中既有能耐高温的抑菌物质,又有遇高温易失活的抑菌物存在。离体和温室防治试验说明,ts-6菌株培养液对灰霉病的防效显著高于菌悬液和无菌滤液。挑战接种间隔期为24h时,无菌滤液的防治效果高于菌悬液;挑战接种间隔期为48h时,菌悬液的防治效果高于无菌滤液。     

特殊生境中土壤放线菌的筛选与鉴定

采用土壤稀释法分离采自江苏及广西农化厂周边的6份土样,获得50株放线菌。以大丽花轮枝孢、尖镰孢萎蔫专化型和尖镰孢西瓜专化型为靶标菌,通过皿内试验及盆栽试验筛选出5株具有较强拮抗活性的放线菌。菌丝生长和孢子萌发抑制试验表明,菌株JSGF4、JSGF10和GXCK1对靶标菌有较强拮抗作用;盆栽试验表明,5株放线菌对茄子黄萎病有良好防治效果,其中菌株JSGF10对茄子黄萎病的防效高达90.0%;对防效较高的4株放线菌进行形态特征、培养特征及生理生化特性分析,鉴定菌株JSGF4为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus),菌株JSGF10和GXCK1为白色链霉菌(Streptomyces albus),GXDM6为灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。     

凤县几种野生植物内生放线菌的分离筛选

用选择性培养基从采自凤县的12种野生植物中分离获得15种放线菌.非寄主作物定殖试验表明分离所获放线菌不仅能够定殖在不同植物体内,而且能定殖在植物的不同部位,具有内生性;皿内拮抗试验结果表明,15株内生放线菌中有2株对5种供试靶标真菌（梨状毛霉菌、西瓜枯萎菌、番茄灰霉菌、粉红聚端孢、苹果炭疽菌）有明显拮抗活性,其中Am3对灰葡萄孢菌抑制率达89.0%.Am5对西瓜枯萎病菌抑制率达81.0%;2株内生放线菌的发酵液对供试靶标真菌也有明显抑制作用,菌体残渣提取物的拮抗活性明显高于发酵滤液提取物.温室番茄、黄瓜防病促生实验结果显示菌株Am3、Am5有较好的防病促生作用,其中经Am3处理过的番茄植株干重比对照植株干重增加120%,对番茄灰霉病的防效达68.9%.     

6株土壤链霉菌的抑真菌活性及其发酵液对采后香蕉果实炭疽病的防效

测定了从海南土壤中分离获得的6株链霉菌(Streptomycessp.)LA5、BM9、BM10、BM11、BM19和BW的抑真菌活性及其发酵液对采后香蕉果实炭疽病的防效。香蕉果实接种香蕉炭疽病菌[Colletotrichummusae(BerkeleyetCurtis)vonArx]0h(指接种后立即浸果处理)和24h后,用6菌株的无菌发酵液浸果。结果表明,这6株放线菌活菌及其无菌发酵液对香蕉炭疽病菌均有较强的抑制作用;接种0h后蘸果处理中,LA5菌株的防效最好,达80.0%,与50%多菌灵800倍液的防效相当;接种24h后蘸果处理中以BW菌株防效最好,达75.0%,显著高于50%多菌灵500倍液的防效(64.6%)。     

紫外线诱导提高重寄生放线菌PR和F46活性的研究

利用紫外线照射诱导两种重寄生放线菌PR和F 46,并对诱导产生的诱变菌株的特性进行了初步研究。结果发现,诱变菌株菌落的基内菌丝的颜色与出发菌落的明显不同。在适合度上,诱变菌株的菌丝生长量有所下降,而在产孢能力、重寄生能力方面则高于出发菌株。诱变菌株对常用化学杀菌剂的抗药性测定结果显示,诱变菌株与一些常用化学杀菌剂是可以混合使用的。     

云南地区月季灰霉菌致病力及抗药性鉴定

【目的】明确云南地区月季灰霉菌的致病力及对不同杀菌剂的抗药性,为生产上月季灰霉病的有效防控提供指导。【方法】采用单孢分离法从云南15个月季切花主产区灰霉病株上分离月季灰霉菌株,将灰霉菌株孢子悬浮液无创伤接种于月季品种粉红雪山完整花瓣上,通过测量花瓣病斑面积大小鉴定不同灰霉菌株的致病力;将灰霉菌株菌丝块接种于添加有不同杀菌剂的PSA培养基中,通过计算菌丝生长抑制率（抑菌率）鉴定月季灰霉菌对甲基硫菌灵、腐霉利、啶菌恶唑、吡唑醚菌酯、啶酰菌胺、嘧菌环胺和吡噻菌胺7种不同类型杀菌剂的抗药性。【结果】从云南地区15个月季主产区采集的灰霉病株中分离获得141株灰霉菌株,根据月季灰霉病田间症状、菌株形态特征及显微特征判定属于葡萄孢属（Botrytis spp.）真菌。不同灰霉菌株致病力差异明显,病斑面积为3.10~781.50 mm2,未检测到完全不致病的灰霉菌株,弱致病力灰霉菌株较少。来自不同切花产区的灰霉菌株致病力差异不明显。月季灰霉菌株对不同杀菌剂的敏感性为:啶菌恶唑（吡啶恶唑啉类）>吡唑醚菌酯（甲氧基丙烯酸酯类）>嘧菌环胺（苯胺嘧啶类）>啶酰菌胺（烟酰胺类）>腐霉利（二甲酰亚胺类）>吡噻菌胺（酰胺类）>甲基硫菌灵（苯并咪唑类）,其中啶菌恶唑、吡唑醚菌酯和嘧菌环胺对灰霉菌的抑制效果最好,抑菌率分别为95.49%、85.78%和77.70%;啶酰菌胺和腐霉利的效果次之,抑菌率为69.73%和64.37%;甲基硫菌灵和吡噻菌胺的效果最差,抑菌率仅为44.36%和56.16%。【结论】云南地区不同月季灰霉菌的致病力差异明显,月季灰霉菌株的致病力与菌株采集地区无关。啶菌恶唑、吡唑醚菌酯和嘧菌环胺可作为目前云南地区月季切花生产中灰霉病防治的主要药剂。     

不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制作用

为了探明不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制效果,本研究测定了2株伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovieniiHJ4)和(X.bovienii HF22)及2株发光杆菌(Photorhabdus luminescens F30-4)和(Pho-torhabdus sp.S21)对灰霉(Botrytis cinerea)的抑菌活性。结果表明:4个菌株的培养液对灰霉病菌均有一定的抑制作用,稀释5倍的培养液对菌丝生长抑制率达70%~85%,稀释10倍的培养液抑菌效果仍达50%以上。其中HF22菌株效果最好,其稀释5倍的培养液抑菌效果可达84.92%;另外,滤液对灰霉病菌的孢子萌发也有一定的抑制作用,其中HJ4菌株效果最好,稀释5倍时达34.98%。HF22菌株的细胞10倍稀释液、滤液10倍稀释液的抑菌率分别为74.19%和18.92%,可见其抑菌物质主要存在于细胞中。用不同温度对HF22菌株的细胞、滤液进行处理,结果表明温度对其滤液抑菌活性无影响,而其细胞能耐50℃处理10 min,但在70℃处理10 min时,其抑菌活性显著下降;HF22菌株的滤液经20 W紫外灯照射0.51、h时,对其抑菌活性无显著影响,而细胞经紫外线照射0.5 h时其抑菌活性则显著降低。     

啶酰菌胺对草莓灰霉病菌的毒力测定及田间防效

采用菌丝生长速率法和果实活体接菌法分别测定了啶酰菌胺(Boscalid)对草莓灰霉病菌(Botrytis cinereaPers.)的室内毒力和对草莓保护作用。结果表明,啶酰菌胺对草莓灰霉病菌有较强的抑制作用,其EC50值为3.9803μg/mL,对草莓灰有较好的保护作用。50%啶酰菌胺水分散颗粒剂1200倍液药后60 d对草莓灰霉病的防效达91.84%。     

内生拮抗放线菌防治番茄灰霉病的研究

从番茄植物组织内分离到一株对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有拮抗作用的放线菌株No.37,此菌株产生的抗菌物质能显著抑制番茄灰霉病菌的菌丝生长和孢子萌发,对盆栽番茄幼苗的预防保护作用和治疗作用分别达到89.7%和80.3%,10倍稀释液的田间防治效果达到84.1%。     

丁香酚对灰霉病菌的抑制活性及对菌丝形态的影响

在室内离体条件下研究了丁香酚对灰霉病菌菌丝生长和菌丝形态的影响,当其使用浓度为200μg/mL时,菌丝干重仅为对照菌丝的11.56%。丁香酚的抑菌效果不受pH值（5-9）的影响。当丁香酚浓度为500-2000μg/mL时,其保护作用防效为81.63%-100%,治疗作用防效为28.45%-59.41%。光镜和电镜观察发现丁香酚处理导致菌丝发生一系列变化：菌丝内部出现空泡化,菌丝表面沉积大量外渗物,菌丝呈不规则缢缩,菌丝内部各细胞器结构紊乱。     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BH21是一株对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC₅₀;利用高效液相色谱技术（HPLC）对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%-99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%-100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L^-1。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440 μg·mL^-1时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC₅₀为144.39 μg·mL^-1。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400 μg·mL^-1时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220 μg·mL^-1时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。