琯溪蜜柚果肉过氧化物酶cDNA的克隆及序列分析

以琯溪蜜柚果肉为材料,运用cDNA克隆的方法,克隆得到了琯溪蜜柚果肉过氧化物酶的cDNA的全长,并对得到的序列进行了一些分析,从分子生物学角度对粒化的研究做了初步的探索。结果表明:琯溪蜜柚果肉PODcDNA全长1263bp,有完整的阅读框,编码351个氨基酸。另外5''非翻译区42bp,3''非翻译区168bp(不包含终止密码子TAA),其中包括一个多聚腺苷酸化信号AATAAA,以及一个含24个腺苷酸的poly(A)尾。由琯溪蜜柚果肉PODcDNA推导的氨基酸序列与无花果(Fi-cuscarica)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、杨属植物(Populus)等同源性较高,分别为:58.6%,67.61%,65.24%,67.14%等。     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

鳡胰岛素样生长因子1基因的克隆及其组织特异性表达分析

为克隆鳡(Elopichthys bambusa)的胰岛素样生长因子1(IGF1)全长cDNA和启动子序列及明确其组织表达特征,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)和染色体步移等技术,从鳡肌肉中获得了IGF1基因的全长cDNA(844bp)和上游启动子部分序列(627bp)。结果表明:IGF1基因包含218bp的5′端非翻译区、140bp的3′端非翻译区和486bp的开放性阅读框(ORF),编码161个氨基酸,包含前44个氨基酸残基为信号肽、70个氨基酸残基的4个功能结构域和C端47个氨基酸残基的延伸肽结构域。启动子无TATA框,但含有一成肌分化抗原(Myo D)结合位点。氨基酸同源性和系统发育分析发现,鳡IGF1与鲤形目其他鱼类的同源性较高(94.41%～99.38%),亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,IGF1在鳡的肝脏中表达最高,而心脏中未见其明显表达。该研究为明确IGF1参与鳡生长发育的机制研究及其在鳡的繁殖育种中的应用奠定了基础。     

盐芥ThNHX1基因的3′RACE

以盐芥为材料,依据拟南芥AtNHX1基因的序列信息设计引物,扩增出盐芥中ThNHX1基因的部分序列,然后使用快速扩增cDNA3′末端(3′RACE)方法,从盐芥中克隆到ThNHX13′cDNA序列。该序列全长680 bp,编码104个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AtNHX1基因的相应序列同源性分别为91%和91.5%,而盐芥ThNHX1基因3′端非翻译区序列与拟南芥相应序列的同源性为68.5%,明显低于编码区。     

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA

钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白, 可以促进钙激活酶活性的发挥, 从而促进肉的嫩化。采用PCR技术, 以山羊肝脏cDNA为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(calpainactivator) 基因, 并进行了序列测定。该片段长1 017bp, 5′—端非翻译区长39bp, 3′—端非翻译区长567bp。编码区长411bp, 编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质, 其理论分子量为14 298Da。与EdonMelloni等(1998) 报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现, 二者仅有五个位点不同。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

一个新的枳NAC基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

以拟南芥的NAC1 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,利用生物信息学方法克隆了柑橘NAC1基因的cDNA序列。以枳(Poncirus trifoliata)花的cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异性引物,利用5'RACE和3'RACE技术,分别获得了NAC1基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的NAC1 cDNA全长,命名为Pt-NAC1。Pt-NAC1全长为1351 bp,含有1个1047 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG起始于25 bp,3'末端非翻译区为280 bp。该cDNA推导编码348个氨基酸,与苹果、拟南芥、杨树中相应序列的同源性分别为64.8%、57.0%、61.3%。生物信息学分析结果表明:Pt-NAC1 cDNA序列中有miRNA164的识别位点,还有高度保守的NAC结构域。构建Pt-NAC1亚细胞定位载体35S-GW-GFP-FJ619349,用基因枪转化洋葱表皮细胞,亚细胞定位结果表明:Pt-NAC1均定位于细胞膜中。     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶（ Cu/Zn-SOD）基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明：双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5′端非编码区,261 bp 3′端非翻译区和453 bp 开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2＋和Zn2＋结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD 蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15249900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

1B Specific LMW-GS Primers Cloned a 1D Located Gene from Wheat Cultivar Xiaoyan 22

In the present study, one unique low-molecular-weight glutenin subunit （LMW-GS） gene. LMWXY22-2 （GenBank no. FJ028810）, was isolated from wheat cultivar Xiaoyan 22 （Triticum aestivum L.） by a pair of genomic specific PCR primers for 1B chromosome. Sequence analysis revealed that LMWXY22-2 was composed of 1 364 bp nucleotides, including a 317 bp promotion region and a 1 047 bp coding region which could be translated into a mature protein of 349 amino acids. In spite of a few minor mutations, the sequence of 5＇ untranslated region （UTR）, the coding region, the deduced N- and Cterminus comparisons indicated that LMWXY22-2 belonged to the reported subunits of LMW-m type and type lII group 5, respectively. Inner gene markers for 1D chromosome together with the phylogenetic analysis revealed that this gene was classified into Glu-D3, which was not in agreement with the I B locus-specific primers for LMW genes completely.     

西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布

采用普通PCR和RACE技术克隆了西伯利亚鲟Acipenser baerii热休克蛋白HSP70 cDNA的全序列,该序列全长为2 343 bp,其中5＇非编码区为140 bp,3＇非编码区为256 bp,可读编码框（ORF）为1 947bp,编码为648个氨基酸。该氨基酸序列中含有HSP70家族的3个特征序列——IDLGTTYS、IFDLGGGTFD-VSIL和IVLVGGSTRIPKIQK,细胞质特征性保守序列为EEVD,C端重复序列为GGMP。该cDNA序列与其它生物的HSP70 cDNA序列一样具有很高的相似性。系统发育树显示,西伯利亚鲟与非洲爪蛙蟾Xenopus laevis、密西西比短吻鳄Alligator mississippiensis、美西螈Ambystoma mexicanum的亲缘关系较近。实时定量分析结果表明,水温为17.5℃时,西伯利亚鲟肝脏、鳃、脾脏、心脏、肌肉、中肠、性腺、脑8种组织中均有HSP70表达,其中HSP70在脾脏中的表达量最高,鳃中的次之,肝脏中最低（P〈0.05）。