苦蘵查尔酮合成酶编码基因(PaCHS1)的克隆及表达谱分析

对苦蘵(Physalis angulata L.)成分药理研究的结果表明,苦蘵果实内存在有效抑制肿瘤细胞生长的活性成分。查尔酮合成酶(CHS)在植物黄酮类物质次生代谢过程中起到了重要作用。本研究利用同源克隆的方法获得了苦蘵CHS基因的全长cDNA序列,命名为PaCHS1。序列分析表明,克隆得到的苦蘵PaCHS1基因全长为1 170 bp, 编码389个氨基酸。生物信息学分析表明,PaCHS1是一个不含核定位序列且定位于细胞质和细胞膜为主的蛋白。实验数据也证实了PaCHS1是一个细胞膜和细胞质定位的蛋白。序列对比显示其与多种植物的CHS蛋白序列高度同源,尤其与小金鱼草的MoCHS1亲缘关系最近。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织器官中,PaCHS1均有表达且表达水平有差异。PaCHS1在果实中表达水平最高,而在茎中的表达水平最低。我们又分析了PaCHS1基因在不同激素处理下的表达变化,结果表明,PaCHS1基因的表达水平受到不同激素的调控,茉莉酸(JA)对PaCHS1有强烈的诱导作用,而赤霉素(GA)、乙烯(ethylene)和细胞分裂素(cytokinin)对PaCHS1有强烈抑制作用。对苦蘵PaCHS1基因的克隆和表达图谱研究,可为研究苦蘵以黄酮类物质为代表的次生代谢途径打下基础。     

ABA对甜瓜果实成熟和软化的调节

以甜瓜为材料,分析了果实发育成熟过程中生理生化变化,克隆了ABA生物合成关键酶9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶基因NCED的保守序列并进行表达分析,研究了ABA,NDGA、1-MCP及1-MCP+ABA对果实成熟软化的影响.结果表明:NCED基因在甜瓜果实始熟期大量表达,内源ABA高峰出现在此之后.乙烯释放量,ACC含量和ACO活性在果实成熟初期极低,其各自峰值的出现迟于ABA高峰10 d左右.外源ABA处理显著促进果实成熟和软化,各项成熟指标比对照提前8 d.NDGA处理效果相反;1-MCP和1-MCP+ABA处理与NDGA处理相似,但效果较小.ABA启动了甜瓜果实成熟,它通过诱导乙烯合成相关酶基因的表达而参与了成熟与软化过程,乙烯则主要在成熟后期,尤其是在果实固有风味形成过程中起主导作用.     

乙烯利和1-MCP对菠萝蜜果实中AheAAT和 AheERF表达的影响

目的 研究乙烯（ETH）和1-甲基环丙烯（1-MCP）处理对菠萝蜜果实成熟过程中醇酰基转移酶（AAT）活性、AheAAT和AheERF1/2转录因子表达的影响,为进一步认识菠萝蜜果实AATs在酯类物质合成中的作用及其调控提供理论依据。方法 以‘海大2号’菠萝蜜果实为试材,果实盛花期选择具有代表性、花期一致的果实挂牌,花后约150 d采收,选择大小和成熟度相同,且无病虫伤的果实,分成3组进行处理。第一组采用1 000 mg?L ^-1 ETH溶液浸泡2—3 min;第二组采用0.5 mg?L ^-1 1-MCP熏蒸处理15 h;第三组作为对照组。在果实成熟过程中定期取样,每次取样3—5个果,测定AAT酶活性、AheAAT和AheERF表达等指标。 结果 通过测定AAT酶活性发现,ETH处理促进了果实的成熟衰老,提前了AAT活性高峰出现的时间,但是降低了酶活性。1-MCP处理抑制了果实成熟衰老,在贮藏前期抑制了AAT的活性,延迟了AAT活性高峰出现的时间,并显著降低了AAT的活性。对AheAAT序列分析发现,其全长1 380 bp,编码459个氨基酸。AheAAT具有酰基转移酶的保守结构域H-x-x-x-D和L-x-x-YYPLAGR活性位点基序,D(N) F(V) GWG附加基序,属于BAHD醇酰基转移酶家族,其氨基酸序列与苹果和梨的相似性最高。同时,从菠萝蜜果实中克隆获得2个ERF转录因子,分别命名为AheERF1/2,其中AheERF1全长648 bp,编码215个氨基酸,与苹果和菜豆的同源性最高;AheERF2全长657 bp,编码218个氨基酸,与苹果、番木瓜的同源性最高。AheERF1/2的氨基酸序列含有64/65个氨基酸残基组成的AP2/ERF保守序列,具有ERF家族转录因子的特征序列。ETH处理使果实中AheAAT表达高峰提前出现,并且下调了AheAAT的表达。ETH处理对AheERF1/2转录因子的影响与AheAAT相同,并且ETH降低了AheERF1/2转录因子与AheAAT的相关性。1-MCP处理延长了菠萝蜜果实的贮藏期。在1-MCP处理后的贮藏前期,AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达呈现显著降低。当AheAAT和AheERF1/2转录因子出现表达高峰时,1-MCP下调了它们的表达。然而,1-MCP对AheERF1/2转录因子与AheAAT的相关性几乎无影响。结论 ETH处理提前了AAT的活性高峰及AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达高峰,降低了AAT的活性,下调了AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达,降低了AheAAT与AheERF2转录因子的相关性。1-MCP处理在贮藏前期抑制了AAT的活性及AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达,在贮藏后期降低了AAT的活性,下调了AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达量。     

乙烯处理对树莓果实呼吸速率及乙烯合成代谢的影响

采集不同成熟期(绿果期、白果期、着色期、成熟期、过熟期)"哈瑞太兹"树莓果实,并利用乙烯利及乙烯抑制剂1-MCP处理白果期果实,测定上述果实不同部位(整果、小核果和花托)乙烯生成速率、呼吸速率、ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)活性及RiACS1和RiACO1基因相对表达量变化。结果表明,花托是树莓果实中产生乙烯的主要部位,果实食用部分小核果乙烯生成和呼吸速率在果实发育期间变化平稳,同时结合树莓果实采后无后熟、常温贮存后易腐烂的特性,推测树莓应属于非跃变型果实。乙烯利处理促进树莓果实提前着色,整果、小核果和花托乙烯生成速率短时内增加,ABA含量显著增加,提高ACS和ACO酶活性及RiACS1和RiACO1基因转录水平,而1-MCP抑制此过程。乙烯利处理对呼吸速率影响较小,但1-MCP处理显著抑制小核果和花托中的呼吸速率。     

桃果实中ACC合酶基因克隆及基因沉默载体构建

植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素.ACC合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默ACC合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生.以中华寿桃为研究材料.采用RT-PCR技术,克隆获得ACC合酶基因.将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5a,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定.测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99%,表明将ACC合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上.     

果树果实保鲜力强弱标记基因ACO

果树果实的成熟期与保鲜是影响其经济价值的重要因素,ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的重要酶,催化ACC合成乙烯,进而催化果实的成熟。研究ACC氧化酶基因(ACO)对标记和提高果实的保鲜力具有重要意义。本研究对中华猕猴桃(Actinidia chinensis)、美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)、杏(Prunus armeniaca)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus domestica)、西洋梨(Pyrus communis)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、桃(Prunus persica)、梅(Prunus mume)、大蕉(Musa ABB)10种果树的ACO基因进行氨基酸序列、蛋白质理化性质及结构、系统发育等生物信息学进行分析,并对这10种果树进行聚类。结果表明:(1)苹果较梅更耐储藏,桃与杏保鲜能力相当,西洋梨和沙梨保鲜力相当,中华猕猴桃和美味猕猴桃保鲜力相当;(2)ACO基因可用于同科物种间保鲜能力的选择,这可能与ACO基因编码氨基酸序列18位点处变异、2OG-Fe II Oxy基因家族的高度保守和ACO的多元作用机制有关;(3)ACO的作用机制为在游离核糖体上合成稳定的亲水性蛋白质后,不经蛋白转运,直接在细胞膜内表面氧化ACC合成乙烯,受基因型和外界刺激的多重影响。因此,果树ACO基因可用于属间物种间果实保鲜能力的选择,是一个重要的功能基因。     

茄子脂氧合酶家族基因全基因组鉴定与表达分析

脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)是一类重要的含非血红素铁的蛋白,在植物生长发育、响应生物和非生物胁迫时起重要作用。为进一步明确茄子中LOX基因及其进化关系,对茄子全基因组进行分析筛选,共鉴定出12个SmeLOX基因。它们分布在茄子1、3、8和9号染色体上。系统发育树分析表明,茄子LOX家族基因可分为9-LOX、type I 13-LOX和type II 13-LOX 3类。此外,利用实时荧光定量PCR对鉴定出的12个茄子SmeLOX基因进行组织表达分析,结果表明,SmeLOX1、SmeLOX4、SmeLOX6和SmeLOX8基因在茄子5种组织(根、茎秆、叶片、花、果实)中均有表达。研究结果为进一步研究SmeLOX基因在茄子生长发育过程中的功能提供了科学依据。     

苹果乙烯响应因子MdERF72对非生物胁迫的响应

【目的】乙烯响应因子（ethylene response factor,ERF）是植物特有的一类转录因子,参与植物根系形成、下胚轴伸长、果实成熟、器官衰老等生长发育过程,在调节植物生物和非生物胁迫反应及果实品质过程中发挥着至关重要的作用。克隆苹果乙烯响应因子MdERF72,通过表达分析和转基因功能分析,研究其在抵御非生物胁迫过程中的功能,为探索MdERF72在植物生长发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以‘王林’苹果（Malus×domestica Borkh.）愈伤组织为试材,利用RT-PCR技术克隆MdERF72,利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等,并利用MEGA5.0构建系统进化树,与拟南芥ERF-B2亚家族进行蛋白序列同源性分析;利用实时荧光定量PCR技术探明其在苹果组织中的表达和果实发育时期的时空表达特征;同时利用实时荧光定量PCR技术检测‘嘎拉’苹果组培苗中MdERF72对ACC、NaCl以及低温的响应;构建基因的过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得稳定遗传的过表达苹果愈伤组织;检测NaCl以及低温处理后,野生型和转基因苹果愈伤组织的鲜重、丙二醛含量、电导率、过氧化氢含量以及超氧阴离子含量的差异。【结果】MdERF72位于苹果第13号染色体上,该基因存在1个ERF家族特有的AP2/ERF结构域。进化树分析结果显示,MdERF72与拟南芥AtERF72序列同源性较高,都属于ERFs家族的B2亚家族。氨基酸理化性质分析表明,MdERF72编码253个氨基酸,预测其蛋白质分子量为27.61 kD,等电点（pI）为5.10。另外,亲疏水预测结果显示MdERF72疏水部分大于亲水部分,表明其属于疏水性蛋白。磷酸化位点分析显示,MdERF72只有苏氨酸磷酸化位点,表明该蛋白可能受到磷酸化作用的调控。MdERF72启动子序列中含有与茉莉酸（JA）、生长素及干旱信号相关的顺式作用元件。MdERF72是乙烯正调控转录因子,在苹果的各组织中均有表达,在果实和茎中表达量相对较高;并且在果实中随着果实的成熟,表达量逐渐升高。苹果组培苗中MdERF72的表达明显受到高盐和低温的诱导。过量表达MdERF72的苹果愈伤组织在高盐和低温胁迫处理下,生长势明显比野生型对照强,电导率,丙二醛、过氧化氢、超氧阴离子的含量都低于野生型,表明MdERF72提高了对盐和低温胁迫的抗性。【结论】MdERF72在响应高盐、低温胁迫过程中发挥着重要的正调控作用,过表达MdERF72可以提高苹果愈伤组织对高盐和低温胁迫的抗性。     

辣椒类甜蛋白基因家族鉴定及表达分析

为了在全基因组水平上了解辣椒类甜蛋白基因(TLP)家族特征,本研究通过生物信息学方法,利用辣椒基因组数据库,对筛选的28个辣椒TLP家族成员进行鉴定,对结构功能、聚类及时空表达进行分析。结果表明,辣椒TLP家族基因主要分为4种结构类型,基因分布在9条染色体上。系统发育分析结果显示,辣椒TLP家族基因属于8个聚类组,其中成员最多的聚类组5中的基因主要来自1号染色体。基因启动子区顺式作用元件分析发现多个激素响应元件、生物/非生物响应元件。时空表达分析结果表明,多数辣椒TLP家族基因在各器官和果实发育的各阶段均有较高表达,各成员在时空表达上具有器官特异性。本研究为辣椒TLP家族基因的克隆及其在植物生长及对抗胁迫方面的研究奠定了基础。     

苹果山梨醇脱氢酶基因家族的克隆及表达分析

【目的】进一步探明苹果中山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase,SDH;EC 1.1.1.14）基因家族的分子特性。【方法】从‘嘎拉’苹果中克隆 SDH基因家族全长 cDNA 序列和gDNA 序列,检测它们在叶片和果实不同生长时期的表达模式。【结果】获得了12个苹果SDH基因家族cDNA序列,依次命名为MdSDH7-MdSDH18。除MdSDH18基因的全长gDNA序列由6个外显子和5个内含子组成,其余基因的全长gDNA序列由2个外显子和1个内含子组成。根据氨基酸序列相似性可以将这些SDH基因分为A和B两类。所有SDH基因在果实不同生长期均有表达,且中后期表达高于初期,但果实初期的SDH活性高于中后期。A类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为幼叶＞衰老叶＞成熟叶,SDH活性也呈现出同样的趋势,但B类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为衰老叶＞成熟叶＞幼叶。【结论】进一步证明了SDH基因在苹果中是以基因家族的形式存在的,且不同的基因家族成员在叶片和果实中有不同的表达特性。     

1-MCP和延迟冷藏对‘早红考密斯’梨货架期间品质 和软化相关基因表达的影响

【目的】针对‘早红考密斯’梨因果肉软化和果实腐烂导致损耗严重等问题,通过分析1-MCP和延迟冷藏处理对‘早红考密斯’梨果实腐烂和货架期软化的影响,解析‘早红考密斯’梨中果实软化相关基因表达模式,旨在为延长‘早红考密斯’梨货架期提供新的理论依据。【方法】‘早红考密斯’梨经1.0 μL?L ^-1 1-甲基环丙烯（1-MCP）处理后,分别在（20±2）℃下放置0、3和6 d后再进行（0±0.5）℃冷藏。冷藏95 d后转入货架期（（20±2）℃）分析果实品质变化,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析多聚半乳糖醛酸酶基因（PG1、PG2）、α-阿拉伯呋喃糖苷酶基因（ARF1、ARF2）和β-半乳糖苷酶基因（GAL4）的表达模式。 【结果】延迟冷藏易导致‘早红考密斯’梨果实软化和腐烂,并且随着处理时间延长,果实腐烂率加剧;与空气密封处理后直接冷藏（CK）相比,1-MCP结合延迟冷藏处理能有效维持货架期果实硬度,抑制果实呼吸速率和乙烯生成速率,减少果实腐烂,保持果实品质,但随着延迟冷藏处理时间延长,果实货架期呼吸速率和乙烯生成速率增加,果实软化进程加快;1-MCP结合延迟冷藏处理可显著抑制果实软化相关基因PG1、PG2、ARF1、ARF2和GAL4等的表达,但随着延迟冷藏处理时间延长,这种抑制效果减弱。【结论】延迟冷藏易导致‘早红考密斯’梨腐烂,因此采后需尽快冷藏;1-MCP抑制软化和腐烂效果明显,结合延迟冷藏处理,在一定程度上有利于‘早红考密斯’梨冷藏后货架期果实软化;PG1、PG2、ARF1和GAL4参与了‘早红考密斯’梨冷藏后货架期果实的软化过程。     

丙烯和1-MCP处理对采后柿果实ACS和ACO基因表达的影响

 【目的】研究丙烯、1-甲基环丙烯（1-MCP）处理对采后柿果实中与乙烯合成相关的ACS、ACO基因特异表达的影响。【方法】以中国涩柿的优良品种‘富平尖柿’为试材,于初熟期采收后将果实分别用丙烯、1-MCP处理,在常温下贮藏,定期检测乙烯释放速率及分组织提取RNA进行Northern分析。【结果】丙烯处理促进ACS、ACO基因表达进而促进内源乙烯合成;1-MCP处理抑制ACS、ACO基因的表达从而抑制内源乙烯合成。不过,二者对ACS、ACO基因表达的作用效果在不同组织中差异较大：1-MCP处理对ACS、ACO基因表达的抑制作用在果皮中最明显,其次是果肉、果心部位,果蒂着生部位处最低;丙烯对ACS、ACO基因表达的促进作用表现为果肉、果心、果皮、果蒂着生部位递增。另外,ACS、ACO基因家族各成员在不同组织的表达也不同,DKACS3基因只在果蒂着生部位表达在其它组织中没有表达,DKACS2基因在丙烯处理果中的4个组织中均有表达。【结论】丙烯处理促进ACS、ACO基因表达,1-MCP处理抑制ACS、ACO基因的表达;ACS、ACO基因在不同组织中的表达差异较大;ACS、ACO基因家族各成员在不同组织中的表达也不同。     

Effects of 1-MCP on Ethylene Synthesis and Metabolism of Apple During Storage

Red Fuji apple (Malus domestica Borkh var. Red Fuji) fruits were used to study the effect of 1-MCP on ethylene biosynthesis metabolism during storage. The results showed that 1-MCP maintained the firmness and inhibited the respiration rate, LOX activity and ethylene production rate of fruits. Further study indicated that 1-MCP inhibited ACS (ACC synthase) activity from the 15th day, increased ACC accumulation,and delayed the appearance of ACO (ACC oxidase) activity peak. The increase of protein kinase activity was also inhibited by 1-MCP during fruit ethylene climacteric time.     

1-MCP对苹果果实贮藏期间乙烯合成代谢的影响

 以红富士(MalusdomesticaBorkhvar.RedFuji)苹果果实为试材,研究了1-MCP(1-methylcyclopropene,1-甲基环丙烯)对果实贮藏期间乙烯生物合成代谢过程的影响。结果表明,1-MCP维持果实硬度、降低果实的呼吸速率、脂氧合酶活性和乙烯的释放。进一步研究表明,1-MCP处理抑制果实贮藏15d后体内ACS活性,增加ACC含量的积累,延迟ACO活性高峰的出现,并抑制果实乙烯跃变期间蛋白激酶活性的升高。     

响应槲皮素诱导的美国白蛾P450基因及CYP6ZB2功能分析

【目的】明确美国白蛾（Hyphantria cunea）响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系,探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应,以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据,从中筛选显著差异表达的P450基因,应用MEGA X软件对5个P450基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析;通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）处理下的表达模式;克隆CYP6ZB2全长cDNA序列,利用RNA干扰（RNAi）技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因,经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2(GenBank登录号：ON032363—ON032367)。系统发育分析表明,这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明,P450...     

低温贮藏下1-MCP处理对大枣呼吸作用及叶绿素含量的影响

[目的]研究1-MCP用于大枣的贮藏保鲜的效果。[方法]以金丝新4号大枣为材料,以不加1-MCP对照,试验采用0.50、1.00、1.50μl/L的1-MCP进行熏蒸处理。5℃贮藏条件下,分别在贮藏后0、10、20、30、40、50 d取样测定不同处理的呼吸速率,乙烯释放量,叶绿素含量。[结果]在整个贮藏期间,大枣果实的乙烯释放速率不断下降,贮藏30 d后,大枣果实的乙烯释放速率处于相对稳定的低水平。经1-MCP处理后的枣果,其乙烯释放速率显著低于对照。贮藏期间大枣果实的叶绿素含量不断下降,而经过1-MCP处理的大枣果实叶绿素分解速率显著低于对照果。[结论]经过1-MCP处理的大枣果实,其呼吸作用显著低于对照,而叶绿素含量显著高于对照。     

窖藏和冷藏条件下鸭梨挥发性物质及其相关基因表达分析

【目的】比较窖藏和冷藏过程中,鸭梨果实品质、呼吸速率、乙烯释放速率、电子鼻特征、挥发性物质及其相关基因表达的差异,进一步解析两种贮藏方式对鸭梨香气物质形成的影响及其机制。【方法】鸭梨采收后以窖藏和冷藏两种方式贮藏,测定贮藏期间果实硬度、可溶性固形物含量（SSC）、可滴定酸（TA）含量、呼吸速率和乙烯释放速率,使用电子鼻检测挥发性物质变化,利用气质联用色谱（GC-MS）测定挥发性物质成分及含量,利用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术分析乙烯生成（PbACS1、PbACO2）及其信号转导（PbETR1、PbETR2、PbERS1a、PbERS1b、PbEIN3、PbERF）、挥发性物质合成（PbAAT1、PbADH2、PbADH3、PbADH5、PbHPL、PbLOX1、PbLOX8）相关基因的表达量变化情况。【结果】冷藏期间,鸭梨果实硬度变化较小,SSC上升,TA含量下降。窖藏时,果实硬度下降比较明显,但对SSC的影响较小,而TA含量增加。与冷藏相比,窖藏下果实呼吸速率较高,乙烯释放高峰提前1个月出现,且其峰值较高。电子鼻可有效区分两种贮藏方式下的挥发性物质,其中W1W、W5S、W2W、W1S这4种传感器对挥发性物质区分起主要作用;窖藏期间果实挥发性物质较多。鸭梨果皮和果肉的挥发性物质包含醛类、酯类、醇类、萜类、烷烃类等,且果皮中含量较高;窖藏果皮和果肉、冷藏果皮和果肉中分别检出36种和33种、28种和24种挥发性物质,窖藏鸭梨较冷藏时生成更多的乙酯类化合物,其中己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、（E,Z）2,4-癸二烯酸乙酯等为果皮主要香味物质,己酸乙酯、丁酸乙酯为果肉主要香味物质。相关基因的表达分析表明,与冷藏相比,窖藏明显上调鸭梨果皮和果肉ACC氧化酶（PbACO2）、脂氧合酶（PbLOX1）和醇酰基转移酶（PbAAT1）相关基因的表达,下调乙烯不敏感转录因子（PbEIN3）的表达。【结论】在贮藏3个月内,与冷藏鸭梨相比,窖藏条件明显促进乙烯生成（PbACO2）和香气合成（PbLOX1、PbAAT1）等基因的表达,此时果实具有较多的香气物质种类和较高含量,表现出香味浓郁的特点。