Generation and Analysis of Expressed Sequence Tags （ESTs） from Muscle Full-Length cDNA Library of Wujin Pig

Porcine skeletal muscle genes play a major role in determining muscle growth and meat quality. Construction of a full-length cDNA library is an effective way to understand the expression of functional genes in muscle tissues. In addition, novel genes for further research could be identified in the library. In this study, we constructed a full-length cDNA library from porcine muscle tissue. The estimated average size of the cDNA inserts was 1 076 bp, and the cDNA fullness ratio was 86.2%. A total of 1 058 unique sequences with 342 contigs （32.3%） and 716 singleton （67.7%） expressed sequence tags （EST） were obtained by clustering and assembling. Meanwhile, 826 （78.1%） ESTs were categorized as known genes, and 232 （21.9%） ESTs were categorized as unknown genes. 65 novel porcine genes that exhibit no identity in the TIGR gene index of Sus scrofa and 124 full-length sequences with unknown functions were deposited in the dbEST division of GenBank （accession numbers： EU650784-EU650788, GE843306, GH228978-GH229100）. The abundantly expressed genes in porcine muscle tissue were related to muscle fiber development, energy metabolism and protein synthesis. Gene ontology analysis showed that sequences expressed in porcine muscle tissue contained a high percentage of binding activity, catalytic activity, structural molecule activity and motor activity, which involved mainly in metabolic, cellular and developmental process, distributed mainly in intracellular region. The sequence data generated in this study would provide valuable information for identifying porcine genes expressed in muscle tissue and help to advance the study on the structure and function of genes in pigs.     

MicroRNA-22 inhibits proliferation and promotes differentiation of satellite cells in porcine skeletal muscle

Pig is an important economic animal in China. Improving meat quality and meat productivity is a long time issue in animal genetic breeding. Micro RNAs(mi RNAs) are short non-coding RNAs that participate in various biological processes, such as muscle development and embryogenesis. mi R-22 differentially expresses in embryonic and adult skeletal muscle. However, the underlying mechanism is unclear. In this study, we investigated mi R-22 function in proliferation and differentiation of porcine satellite cells(PSCs) in skeletal muscle. Our data show that mi R-22 expressed in both proliferation and differentiated PSCs and is significantly upregulated(P0.05) during differentiation. After treated with the mi R-22 inhibitor, PSCs proliferation was significantly increased(P0.05), as indicated by the up-regulation(P0.01) of cyclin D1(CCND1), cyclin B1(CCNB1) and down-regulation(P0.05) of P21. Conversely, over-expression of mi R-22 resulted in opposite results. Differentiation of PSCs was significantly suppressed(P0.05), evidenced by two major myogenic markers: myogenin(Myo G) and myosin heavy chain(My HC), after transfecting the PSCs with mi R-22 inhibitor. Opposite results were demonstrated in the other way around by transfection with mi R-22 mimics. In conclusion, the data from this study indicated that mi R-22 inhibited the PSCs proliferation but promoted their differentiation.     

基于全转录组测序的绵羊胚胎不同发育阶段 骨骼肌circRNA的分析与鉴定

【目的】肉用性状是家养动物的重要性状,尤其是产肉性能与骨骼肌的发育密切相关,对多数动物而言,骨骼肌的生长取决于肌纤维的早期发育。本研究将揭示绵羊（Ovis aries）胚胎期骨骼肌组织发育重要节点、肌纤维的形成及转换机制,探究骨骼肌在动物胚胎期的生长对后续发育潜力的影响。【方法】在前期绵羊胚胎期组织结构试验的基础上,选择肌纤维发育及类型转换的3个重要时间节点：胎龄85 d（D85）、105 d（D105）、135 d（D135）,并对处于这些节点期的中国美利奴绵羊胚胎背最长肌进行全转录组测序。通过生物信息学分析和功能预测筛选出差异表达显著的circRNA,采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）对其进行验证。【结果】通过条件筛选（|log2| ≥1且P≤0.05）获得差异表达circRNA 1 126个。将3组进行比较,在各时间节点都发现较多的特异性表达circRNA。在D85 vs D135比较组中,特异性差异表达数量最多：共发现差异表达circRNA 374个,上调表达201个,下调表达173个,其中具有4倍以上差异的基因167个,占差异基因的44.7%。对这些差异性表达的circRNA进行GO和KEGG功能分析和靶向预测,富集到与肌肉分化和肌纤维发育相关的能量代谢和信号转导通路,包括MAPK、PI3K-Akt、Ras、Regulation of actin cytoskeleton等。结果表明：在D85至D105期间富集到的差异circRNA多与肌细胞发育调控、细胞增殖和存活、细胞周期等相关,而在D105至D135期间富集到的通路则主要与能量转换、物质运输、RNA转运和DNA修复有关。靶向预测结果通过Cytoscape软件绘制出可视化共表达网络,筛选到circRNA8239、circRNA19073,circRNA2765、circRNA1616等核心调控转录物,并在D105找到调节快慢肌类型转换的关键因子circRNA7527,其靶向作用于bta-miR-135a、bta-miR-615、chi-miR-133a-5p进而调控MEF2C基因。通过3个时间节点的差异表达情况和功能预测描述选取了与肌肉发育相关的4个核心circRNA和其靶向的4个miRNA进行qRT-PCR分析,其基因表达趋势与测序数据一致。【结论】本试验在转录水平上验证了绵羊胚胎发育D85至D105是肌纤维数量的稳定发生期,而D105至D135则是肌纤维的肥大期,由此推断D105可能是绵羊胚胎发育的关键时间窗口。本研究首次基于全转录组测序构建了绵羊胚胎期骨骼肌发育的circRNA图谱,揭示了不同发育阶段的转录组差异,并对绵羊胚胎骨骼肌发育期间重要的调控因子进行挖掘和验证,发现了以MEF2C为靶基因的多个circRNA和miRNA参与MAPK信号通路,为绵羊肌纤维发育分子机制以及其它家畜非编码RNA的研究提供了参考。     

Cloning and Characterization of Porcine TSARG7 Gene and Analysis of Its Tissue-Specific Expression

TSARG7 is a novel member of the acyltransferase family since its sequence possesses the highly conserved phosphate acyltransferase （PlsC） domain existing in all acyltransferase-like proteins. The porcine TSARG7 had been identified by cloning in silico but had not been confirmed experimentally. The full-length mRNA of porcine TSARG7 gene was sequenced and two splice variants were discovered. The full-length cDNA of TSARG7 variant 1 was 2 513 bp and variant 2 was 2 634 bp. The putative porcine TSARG7 proteins, which were located in the cytoplasm, encoded 458 and 456 amino acids, respectively. Real-time PCR analysis showed that TSARG7 gene was expressed in various tissues, but at different levels. The expression levels of this gene were higher in the skeletal muscle, heart, and testis than that in other tissues, suggesting that the TSARG7 gene played a role in procine skeletal muscle, heart, and testis functions.     

骨骼肌肌纤维形成机制的研究进展

骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分,占到产肉动物躯体的40%,肌纤维作为骨骼肌组织的主要成分,其类型的差异是影响产肉动物肌肉品质的重要因素之一。因此,骨骼肌的生长发育与产肉动物肉的产量有着密切的联系,而其生理生化特性的差异也将会直接影响到产肉动物屠宰之后肉品的质量。一般而言,动物骨骼肌肌纤维数目在胚胎发育期间基本上就已固定,出生之后,由于肌纤维的肥大,动物躯体肌肉块才表现出增大增粗。另外,动物肌肉块在生长发育过程中,其肌纤维组成类型并不是完全固定的,它们会随着骨骼肌对代谢与功能需求的改变而发生转变。骨骼肌的生长发育,以及骨骼肌肌纤维类型的发生与发展是一个非常复杂的生物学过程,受到许多信号通路与因子的调控。随着分子生物学技术的飞速发展,各种先进技术相继被应用于生物学现象的研究中,利用这些分子生物学技术很好的阐明了许多复杂生物学现象形成的分子机制。目前,骨骼肌生长发育的分子遗传调控机制取得了长足的进展,许多与骨骼肌形成发育相关的关键因子已被鉴定出来。然而,在早期研究中,人们对于骨骼肌肌纤维的研究主要集中在类型的鉴定,以及不同肌纤维类型生理生化特性的分析,对于骨骼肌肌纤维形成的具体分子遗传调控机制的研究相对较少。近年来,随着研究的不断深入,骨骼肌肌纤维形成的分子遗传调控机制也取得了突破性的进展。因此,有必要进一步对骨骼肌肌纤维类型的特性,骨骼肌肌纤维类型形成的分子机制,以及肌纤维类型与肌肉品质的关系进行全面的综述。本文首先对肌纤维的类型、特性进行了综述;进一步分别对慢型肌纤维与快型肌纤维形成的分子调控机制的研究进展进行了回顾;最后对肌纤维类型与肉品质的关系进行了讨论。总之,本综述的撰写将有助于对骨骼肌肌纤维类型形成的遗传机制的进一步了解,为将来进一步的深入研究肌纤维形成的分子机制提供参考;同时也将有助于揭示肌肉品质形成的分子遗传调控机制,为利用分子生物学技术培育高品质新品种或新品系产肉动物提供分子理论依据。     

基于绵羊胚胎骨骼肌蛋白质组学的PI3K-AKT信号通路分析

【目的】绵羊是重要的经济动物,其骨骼肌生长发育与产肉性能密切相关。胚胎期是绵羊骨骼肌生长发育的关键阶段,挖掘分析绵羊胚胎骨骼肌蛋白质组数据,为揭示绵羊肌肉发育重要时间节点、筛选绵羊胚胎骨骼肌生长发育调控蛋白质提供依据。【方法】本团队已对妊娠第85天、第105天和第135天的中国美利奴绵羊胚胎背最长肌进行串联质谱(tandem mass tag, TMT)蛋白质定量,鉴定到1316种差异丰度蛋白质。现利用GO、KEGG和R等方法对这些差异丰度蛋白质开展聚类、功能注释和通路分析等生物信息学分析。【结果】基于前期研究结果对差异丰度蛋白质进行R语言聚类,分析结果显示,cluster 5类蛋白在胚胎骨骼肌第105天具有较高丰度。对cluster 5 蛋白进行GO和KEGG富集分析发现,该类蛋白质参与胞内蛋白质代谢过程,显著富集于PI3K-AKT信号通路中,而在该信号通路中RAC-β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶X1(AKT2)具有较高表达丰度。蛋白质生物信息学结果表明,AKT2蛋白由481个氨基酸构成,AKT2蛋白理论分子量为55.58kD,由66个带正电荷的氨基酸残基和72个带负电荷的氨基酸残基组成,理论等电点为6.08,亲水性平均系数-0.454,属于亲水性蛋白。预测AKT2蛋白的481个氨基酸全部位于膜外,属于膜受体蛋白。AKT2蛋白有12个N-端糖基化位点,71个磷酸化位点,与蛋白酶K相似度为99%,属于蛋白酶催化亚基家族。【结论】绵羊胚胎骨骼肌蛋白质组数据发现,第105天是绵羊胚胎骨骼肌纤维由增殖分化到增大增粗的转折点,具有调控绵羊胚胎骨骼肌纤维生长发育作用的PI3K-AKT信号通路在该节点显著富集,AKT2是调控该信号通路的重要候选蛋白。综上,本研究结果对揭示胚胎骨骼肌生长发育及其调控分子机制具有重要理论指导意义。     

非生物胁迫下青花菜LncRNA内参基因的筛选

长链非编码RNA在植物抵御逆境胁迫中起着重要作用。适宜的内参基因是准确评价其表达水平的基础。本研究利用实时荧光定量PCR技术检测16个青花菜LncRNAs表达水平,并通过geNorm、NormFinder、BestKeerper软件进行表达稳定性分析。结果表明：青花菜的16个LncRNAs在不同逆境胁迫下表达稳定性存在差异。其中在弱光胁迫条件下, XLOC_000400表达最稳定;在低温胁迫条件下 XLOC_030832基因稳定性最好;在干旱和渍水胁迫条件下最稳定表达的内参基因分别是 XLOC_007087和 XLOC_012179;高温和盐胁迫处理下最稳定表达的内参基因均为 XLOC_007980。 XLOC_010342和 XLOC_007980在青花菜不同逆境胁迫下的表达稳定性较好。研究结果可为准确定量青花菜不同逆境胁迫下的LncRNAs提供合适的内参基因。     

猪COPG2和MEST克隆、印记状况和组织表达分析

【目的】为了在猪中找到更多新的候选印记基因并分析它们在哺乳动物之间的保守性,以期为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息和分子标记。【方法】以长白与荣昌猪杂交F1 代一月龄个体为研究对象,通过比较生物学的方法,克隆COPG2和MEST全长cDNA,并分析基因的序列特点,然后利用 IMpRH(法国农业科学院的辐射杂种克隆板)分析COPG2和MEST在猪染色体上定位信息。通过RT-PCR产物直接测序方法分析了这些基因在一月龄F1代个体11个不同组织(心、胃、肌肉、肾脏、肺、肝、小肠、膀胱、舌头、脾和脂肪)的印记状况,并进一步利用Real-time PCR方法,分析其在一月龄F1代个体11个不同组织的表达情况。【结果】克隆得到2 817 bp COPG2和2 219 bp MEST序列。其中COPG2 包括2 616 bp 完整CDS(coding sequenc,编码序列)区域,分析表明其编码含871个氨基酸的蛋白质,MEST包括981 bp完整CDS区域,编码326个氨基酸的蛋白质。IMpRH分析结果表明,猪COPG2和MEST都位于猪18号染色体上并且与标记CL365941紧密连锁,LOD值分别为14.32和8.5。印记分析表明COPG2在11个组织中呈双等位表达,MEST在心脏、胃、肌肉、肾、肺、膀胱、舌头和脂肪中表达父方等位基因,但在肝脏、小肠和脾脏中呈双等位表达。荧光定量结果显示COPG2 和MEST总的表达量在一月龄个体各组织间存在着显著性差异(P＜0.01),其中COPG2和MEST在肾脏中表达量均高于其它各组织(P＜0.01)。【结论】在哺乳动物之间,COPG2序列较为保守但是印记状况却缺乏保守性;MEST序列和印记状况均较为保守,但MEST在猪中印记状况具有组织特异性。此外,染色体定位信息和印记状况证实了在猪的18号染色体上有由COPG2和MEST构成的新的印记域。     

用高通量测序技术研究松辽黑猪与长白猪背最长肌 mRNA和lncRNA的差异表达

【背景】肌肉生长和脂肪沉积是猪生产中非常重要的经济性状,同时也是复杂的数量性状,受到众多因素的影响。长白猪原产于丹麦, 是目前世界上使用最为广泛的瘦肉型猪种之一, 具有生长速度快, 瘦肉率高等特点,但肉质欠佳。松辽黑猪是以民猪、长白猪和杜洛克猪为素材经过三元杂交育成的黑色母系地方培育品种,具有繁殖率高、肉质优良、适应性强、耐粗饲等特性。二者在肉质方面存在较大差异。【目的】采用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪的背最长肌转录组进行分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）,为猪肉品质研究提供新的参考信息。【方法】采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌作为样本,提取其RNA,将每个品种内的个体取等量RNA混池,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对混池后的样本RNA进行测序,然后对所获得的Reads进行比对、注释和差异表达等分析,筛选出差异表达mRNA和lncRNA并进行相关生物学功能富集分析。而后在筛选出的差异表达mRNA和lncRNA中各挑选10个基因,包括5个上调基因和5个下调基因,采用荧光定量PCR（Real-time PCR, RT-PCR）方法鉴定所选mRNA和lncRNA的表达水平,并验证测序结果的可靠性。【结果】将得到的原始数据进行质量控制后,每个样本分别得到103 M和150 M reads,其中98%以上reads质量较高,满足进行下一步分析的要求。将reads比对到参考基因组上,共得到26 774个转录本,其中包括8 428个新的转录本。采用edgeR软件包进行差异表达分析,参考标准是错误发现率（false discovery rate, FDR）小于0.05和差异倍数大于2（fold change, FC）。在2个猪种中共得到4 239个显著差异表达的mRNA,其中在松辽黑猪肌肉中2 023个上调,2 216个下调。其中HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1和ZNF7等基因参与脂类代谢和肌肉发育相关的调控。差异表达的mRNA的生物学功能富集分析发现,其主要富集在细胞发育、生物代谢调控、肌肉发育、脂类代谢等相关的信号通路和生物代谢途径上。同时,在2个猪种中还检测到的178个差异表达显著的lncRNAs,其中在松辽黑猪肌肉组织中有84个上调,94个下调。联合差异表达lncRNAs的靶基因预测和差异表达基因结果分析,显示有4个差异表达的lncRNA与差异表达mRNA存在潜在的调控关系,分别是TCONS-00041713、TCONS-00041712、ENSSSCT00000034982、ENSSSCT00000034269。同时10个差异表达mRNA和10个差异表达lncRNA的RT-PCR结果显示：其表达水平在两组中同样差异显著,且与转录组测序中表达的趋势相似,表明高通量测序结果具有可靠性。 【结论】 获得了影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和lncRNA,同时发现了几对差异表达lncRNA和mRNA之间可能存在着潜在的调控关系。这些潜在调控关系的发现,可能对于研究调控肌肉组织代谢活动的分子机制的具有一定意义,并为其提供新的参考信息。     

猪背最长肌与腰大肌microRNA表达谱分析

【目的】为研究microRNA在猪肌肉生长发育中的作用。【方法】采用Illumina高通量测序技术对猪背最长肌和腰大肌的microRNA转录组进行测定,并鉴定差异表达的microRNA。【结果】在猪背最长肌和腰大肌文库中分别产生了15.22M和17.52M的序列;两个文库共检测到的695个microRNA,其中有363个共表达、193个差异极显著(P<0.01)。【结论】说明microRNA在不同骨骼肌类型中存在差异表达。     

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。     

A MicroRNA Catalog of Swine Umbilical Vein Endothelial Cells Identified by Deep Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous ∼22 nt RNAs that play important regulatory roles in targeting mRNAs for cleavage or translational repression. Despite the discovery of increasing numbers of human and mouse miRNAs, little is known about miRNAs from pig. In this study, we sought to extend the repertoire of porcine small regulatory RNAs using Solexa sequencing. We sequenced a library of small RNAs prepared from immortalized swine umbilical vein endothelial cells (SUVECs). We produced over 13.6 million short sequence reads, of which 8547658 perfectly mapped to the pig genome. A bioinformatics pipeline was used to identify authentic mature miRNA sequences. We identified 154 porcine miRNA genes, among which 146 were conserved across species, and 8 were pig-specific miRNA genes. The 146 miRNA genes encoded 116 conserved mature miRNAs and 66 miRNA*. The 8 pig-specific miRNA genes encoded 4 mature miRNAs. Four potential novel miRNAs were identified. The secondary structures of the 154 miRNA genes were predicted; 13 miRNAs have 2 structures, and miR-9 and miR-199 have 4 and 3 structures, respectively. 36 miRNAs were organized into 19 compact clusters. miR-206, miR-21 and miR-378 were the relatively highly expressed miRNAs. In conclusion, Solexa sequencing allowed the successful discovery of known and novel porcine miRNAs with high accuracy and efficiency. Furthermore, our results supply new data to the somewhat insufficient pig miRBase, and are useful for investigating features of the blood-brain barrier, vascular diseases and inflammation.     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

基于表达谱芯片挖掘鸡骨骼肌不同类型肌纤维的差异表达基因

【目的】肌纤维类型的差异是直接影响肌肉生长发育和肉品质的重要因素,红肌纤维比例高的肌肉肉品质要显著优于白肌纤维比例高的肌肉,然而,目前对于鸡骨骼肌纤维类型形成及转换的分子调控机制尚不明确。本究以中国优良的地方品种清远麻鸡为研究对象,首次对其骨骼肌中不同类型肌肉的转录组差异进行了研究,以期挖掘在鸡肌纤维生成和类型转换中发挥调控作用的关键因子。【方法】采用Agilent鸡全基因组表达谱芯片对清远麻鸡骨骼肌表型差异较大的比目鱼肌和趾长伸肌中与肌纤维类型组成和转换相关的候选基因进行系统筛查,采用荧光定量PCR对芯片筛选出的差异表达基因进行验证,采用慢病毒质粒包装系统构建特异靶向鸡PPARGC1A基因的RNA干扰慢病毒载体进行基因功能研究。【结果】芯片结果共发现差异倍数在2倍及以上的基因1 224个(P0.05,FC≥2),以趾长伸肌作为参照,比目鱼肌中上调基因为654个,下调基因为570个,尽管芯片和荧光定量PCR两种方法得出的差异倍数并不完全一致,但所选基因的表达趋势是一致的,表明芯片结果是可靠的。对差异表达基因进行GO(GO ontology)功能分类,共发现了74个显著性GO,主要分为生物学过程、分子功能和细胞组分等3大类。基于KEGG Pathway分析发现,一些已知的与肌纤维类型转换、肌肉发育以及脂质代谢相关的信号通路在两种类型的肌肉中被显著富集。综合差异基因的GO、KEGG Pathway和共表达网络分析,推测PRKAG3,ATP2A2以及PPARGC1A可能是与肌纤维类型性状紧密关联的关键基因。进一步对PPARGC1A基因进行功能研究发现,PPARGC1A基因的敲低,引起了PPP3CA,MEF2C以及SM等慢肌纤维标志基因以及与肌纤维发育与转换相关基因表达水平的显著降低,而快肌纤维标志基因FWM的表达水平则显著上升。【结论】揭示了鸡红肌和白肌两种不同类型肌肉间的转录组差异,证明了PPARGC1A基因能够与钙离子信号通路相关基因协同从而在鸡肌纤维类型组成和转换中发挥着重要作用,从而为中国地方鸡肉品质性状的遗传改良提供一定的理论依据。     

IGF1-PI3K-Akt信号通路相关基因在黄羽肉鸡肌肉和肝脏中的表达

【目的】IGF1-PI3K-Akt信号通路是调控生长发育的关键通路,选择慢速型的广西麻鸡和中速型的花山麻鸡作为研究对象,探究IGF1-PI3K-AKT信号通路相关基因胰岛素样生长因子1( Insulin-like growth factors, IGF1)、胰岛素样生长因子1受体( Insulin- like growth factor receptor, IGF1R)和胰岛素受体底物1 (Insulin receptor substrate1, IRS1)在骨骼肌和肝脏中的发育性表达规律,为阐明黄羽肉鸡生长发育调控机理提供参考。【方法】采用SPSS20.0比较广西麻鸡和花山麻鸡在胚胎期至出生后早期的生长发育差异,采用实时荧光定量PCR方法检测上述3个基因在两个品种鸡胚胎期（9、12、16胚龄）和出生后（0、7、21、35、49和63日龄）胸肌、腿肌和肝脏中的表达差异,并将其与体重和组织重进行相关性分析。【结果】鸡生长发育早期体重、骨骼肌重和肝脏重变化呈现显著的品种和时间特异性,经过选育的花山麻鸡体重和组织重的增长在胚胎发育后期已经远远超过广西麻鸡。IGF1、IGF1R和IRS1基因表达存在显著的品种、组织和发育时段特异性,总体上,在胚胎期肌肉中的表达量高于肝脏组织,出生后则为肝脏中的表达量高于肌肉组织,广西麻鸡肌肉中的表达量高于花山麻鸡,而花山麻鸡肝脏中的表达量要高于广西麻鸡。IGF1基因在两个品种胸腿肌中均在9胚龄即可检测到表达,腿肌中表达量均是9胚龄时最高,除与12胚龄差异不显著外,与其他各阶段差异显著,表达量最低点出现在出雏0日龄时;胸肌中则是12胚龄时表达量最高,63日龄时最低;肝脏中则出现品种差异,广西麻鸡胚胎期未检测到表达,从出雏0日龄开始表达,表达高峰出现在21日龄时,而在花山麻鸡中虽然胚胎期检测到表达但表达量极低,49日龄时达到表达高峰。两品种鸡肌肉和肝脏各个阶段均检测到IGF1R mRNA的表达,在胸肌和腿肌中的表达量均表现为9胚龄最高,广西麻鸡9胚龄与其他各阶段差异显著,花山麻鸡9胚龄除与12胚龄差异不显著外,与其他各阶段均差异显著;肝脏中,广西麻鸡表达高峰出现在21日龄,且与9、12、16胚龄和0日龄差异显著,花山麻鸡则是63日龄时最高,与其他各阶段差异显著。两品种鸡肌肉和肝脏各个阶段均能检测到IRS1 mRNA的表达,在两品种肌肉中的表达量均表现为9胚龄或者12胚龄最高,与其他各阶段差异显著,随后下降,并在出雏后维持在较低水平;肝脏中IRS1的表达模式与IGF1R一致。IGF1、IGF1R和IRS1基因的表达两两之间均表现出显著或极显著的正相关关系,同时,肌肉中3个基因的表达与体重、胸（腿）肌重存在显著的负相关,而肝脏中3个基因的表达与体重、胸（腿）肌重、肝脏重均存在显著的正相关。【结论】IGF1-PI3K-AKT信号通路相关基因之间存在一致性趋势,品种间和组织间表达量的差异可能正是不同类型黄羽肉鸡生长发育差异的主要原因之一。     

猪体内与孤雌激活早期胚胎发育特定阶段差异表达基因筛选

 【目的】研究早期胚胎发育基因,筛选猪早期体内发育胚胎和体外孤雌激活胚胎的差异表达基因,探讨影响胚胎发育的分子基础。【方法】分别采用孤雌激活和手术（猪体内发育）的方法收集2细胞、4细胞、8-16细胞时期的胚胎,利用SPEDDRT-PCR挑选不同时期的差异表达产物,将所获得的产物按照片段大小分离纯化后通过反向Northern杂交去除假阳性条带。将阳性条带克隆入T载体中,经过PCR鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序。【结果】筛选了11个代表不同时期表达差异的cDNA片段,编号为DDD1-DDD11。经过与GenBank数据进行同源性分析,发现其中DDD3、DDD11没有同源序列信息,提交数据库获得GenBank登录号（EU597224、EU597228）,其余序列发现相似性较高的数据。【结论】对体内正常发育胚胎和孤雌激活胚胎进行对比、分析,发现体内4细胞期和体内8-16细胞期各有1个片段为新基因片段,为进一步分析发育相关基因及其功能奠定基础。     

基于全基因组重测序分析藏猪骨骼肌发育相关基因

为从全基因组水平探索影响藏猪骨骼肌发育的遗传变异，本研究对5头迪庆藏猪进行全基因组重测序，并合并NCBI数据库中来自3个省的藏猪、与藏猪同样小体型及生长慢的巴马香猪、及体型大且生长快速的杜洛克和大白猪共70个猪只的全基因组重测序数据进行整合分析，获得全基因组SNP后结合选择信号检测与等位基因频率(AF)分析鉴定藏猪-香猪与杜洛克-大白猪的遗传差异；利用GO和KEGG功能富集分析藏猪骨骼肌转录组与蛋白组相关基因。结果发现:1)2 211个基因在藏猪-香猪与杜洛克-大白猪2个比较组中存在遗传差异，138个基因富集到骨骼肌发育相关的GO功能集及KEGG通路；2)9个基因(UCHL3、POSTN、COL12A1、PGK1、JPH1、GPT2、RBFOX1、FLNB和DCX)已报道参与藏猪60 d胚胎背最长肌发育调控，1个(CKM)参与6月龄藏猪背最长肌发育调控；3)10个基因共包含936个SNP，其中655个SNP位于基因间区，255个是内含子变异，少量SNP是外显子及调控区变异。本研究从全基因组水平鉴定了与藏猪骨骼肌发育相关基因及其遗传变异，为以后持续深入解析藏猪骨骼肌发育的遗传机制提供参考。