基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

海水希瓦氏菌(Shewanella aquimarina)PCR检测方法

海水希瓦氏菌（Shewanella aquimarina）是虾夷马粪海胆的一种致病菌。为建立海水希瓦氏菌PCR快速检测方法,根据海水希瓦氏菌gyrB基因的高变区序列设计3对引物,随后进行了其特异性和灵敏度分析。结果显示引物SA-9可扩增出片段大小为815 bp的海水希瓦氏菌特异片段。引物可检测的最低细菌量为4.6×103 cfu/mL,最低DNA含量为3.15×10-4 ng/μL。表明以SA-9为引物的PCR检测方法特异性强,灵敏度高。 另外以该方法对海胆及其生境样品进行初步检测,发现健康海胆、养殖海水及投喂海带为阴性,而自然海域的海水具有一定量的海水希瓦氏菌。     

致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

芒果SRA P-PCR反应体系的优化与退火温度的筛选

以芒果为材料,通过单因子模板DNA含量、引物含量、2× Taq PCR Master Mix含量3种因素水平进行试验,建立了SRAP反应的优化体系。结果表明：最佳反应体系为20μL ,包括24 ng 模板DNA ,8 pmL引物,2× Taq PCR Master Mix 10.0μL。该体系对芒果扩增效果好,电泳结果显示扩增条带清晰,多态性高,而且操作简单。从81对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的29对引物组合。在此基础上对退火温度进行探索,发现扩增结果对退火温度变化不敏感。     

副猪嗜血杆菌四环素耐药基因TetB的PCR检测方法建立

在本实验室前期研究的基础上,选取与四环素耐药表型相关性较好的TetB基因,建立PCR方法,以探索副猪嗜血杆菌耐药性的快速检测方法。本研究利用四环素主要耐药基因TetB的引物,对PCR反应条件进行优化,以副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板,未出现非特异性扩增条带,PCR扩增条带单一。将TetB基因克隆至pMD 19T载体,以重组质粒为标准品,确定了最低检测拷贝数,经测定,最低检测拷贝数为154×103。以不同稀释度的21A7菌株基因组DNA为模板,确定了最低细菌检出量,经测定,最低检测细菌数量为46×103个。该方法为建立临床快速检测副猪嗜血杆菌耐药性奠定了基础。     

仿刺参及养殖环境中溶藻弧菌和灿烂弧菌的PCR快速检测

溶藻弧菌和灿烂弧菌是水产养殖中常见的致病菌,给水产动物的养殖带来巨大的损失,建立一种简便、快速、有效的检测方法十分必要。根据溶藻弧菌和灿烂弧菌gyrB基因序列的保守区序列分别设计引物,对9株溶藻弧菌和6株灿烂弧菌进行了PCR扩增。结果表明两对引物能特异地检测溶藻弧菌和灿烂弧菌,而与其他细菌没有交叉反应;检测溶藻弧菌的每个PCR反应的敏感度为0.13 pg的DNA和103 cfu/mL细菌,检测灿烂弧菌的每个PCR反应的敏感度为0.34 pg的DNA和103 cfu/mL细菌。该PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,可用于对感染溶藻弧菌和灿烂弧菌的仿刺参及其养殖水体中的细菌性病原进行快速检测。     

云杉叶疫病根球壳孢菌的分子检测

从四川二郎山人工云杉林分离得到云杉叶疫病病原菌,采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增得到的序列与NCBI中的根球壳孢菌(Rhizosphaera kalkhoffi)相似度达99%。比较分析了NCBI及四川二郎山分离到的根球壳孢菌ITS区序列,采用软件primer5.0设计20个引物。通过对32株菌株DNA进行PCR扩增及产物测序,筛选得到3个特异性引物对ZYZ6、ZYZ7、ZYZ8。改变DNA模板浓度进行扩增检测,在25μL PCR反应体系中,引物对ZYZ6F/ZYZ6R检测灵敏度最高,可达到0.1 pg/μL。利用ZYZ6F/ZYZ6R对四川二郎山人工云杉针叶DNA进行检测,扩增得到310 bp左右的条带,测序结果与Gen Bank中根球壳孢菌相似度达99%。     

色素辣椒InDel-PCR反应体系优化及引物筛选

为建立和优化色素辣椒的InDel标记PCR反应体系,筛选多态性良好且重复性高的引物,为InDel分子标记在色素辣椒辅助育种、品种纯度鉴定及遗传多样性分析等提供可靠的技术支持.采用正交试验、单因素试验方法,对影响扩增体系中的模板DNA用量、引物浓度、2×Taq PCR Mix添加量等参数进行3因素4水平的正交试验比较分析,对循环数进行单因素试验优化分析.结果表明,对InDel-PCR体系扩增结果的影响程度中引物浓度最大,其次是模板DNA用量,而2×Taq PCR Mix添加量的影响不大.根据检测结果,出于成本和模板DNA用量的考虑,确定最佳InDel-PCR反应体系(10μL):模板DNA用量为35 ng、引物浓度为0.5μmol/L、2×Taq PCR Mix添加量为5μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,退火30 s,72℃变性60 s,35个循环;72℃变性5 min;扩增产物在4℃保存.从240对InDel通用引物中最终筛选出14对适用于色素辣椒InDel-PCR候选引物.InDel标记是基于PCR的分子技术,选择适宜的引物及模板DNA浓度对扩增出清晰、稳定的条带很重要,优化后的10μL InDel-PCR反应体系及扩增程序,成功筛选出14条多态性较高的InDel引物,为后续的色素辣椒分子标记研究提供了可靠技术依据.     

疣蝗肠道好氧细菌的分离及ARDRA多态性分析

将疣蝗中肠样品倍比稀释后涂布平板分离菌株,共分离得到11株好氧细菌。以细菌基因组DNA为模板,用细菌16SrDNA通用引物（27f,1492r）对模板扩增,并用4种限制性内切酶HaeⅢ和HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ对PCR扩增产物进行ARDRA多态性分析。对聚类图谱的分析结果发现,11株好氧细菌在82%的水平上聚成3个不同分类操作单元（OTU）,表明疣蝗肠道内好氧细菌的遗传多样性水平偏低。     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定.     

澳洲坚果SSR体系的建立及F_1代的鉴定

为了探索澳洲坚果SSR-PCR的可行性,采用单因素分析法对影响PCR的各个因素进行分析,建立SSR-最佳反应体系。结果表明:在25μL PCR反应体系中,当Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量分别为2.50 mmol/L、0.10 mmol/L、0.40μmol/L、1.25 U时,PCR扩增效果最好。筛选到19对可得到扩增结果的SSR引物,其中有2对在以900为母本、294为父本的组合中PCR扩增结果存在差异,可以应用于900×294组合的F1代鉴定。     

部分柿属植物TRAP标记反应体系的建立与引物筛选

为了建立柿属植物目标区域扩增多态性(TRAP)标记技术体系,对影响TRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、固定引物和随机引物浓度比5个因素进行了优化。确定优化的反应体系为:模板DNA 40 ng,buffer 1×,Mg2+1.4 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,固定引物和随机引物浓度比为11∶1,Taq酶0.5 U,反应总体积为15μL。利用柿属植物EST数据库信息设计锚定引物10条,与11条随机引物组合共110对引物。利用这些引物对柿属植物6个基因型进行TRAP-PCR扩增,其中84个引物组合能扩增出清晰条带,占引物总量的76.36%;36个引物组合表现出良好的多态性扩增,并在20份柿属植物中进行了引物验证。     

ISSR、RAPD和SRAP分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的应用比较

利用ISSR、RAPD和SRAP3种分子标记法对16株姬松茸菌株进行比较分析。结果表明其中8条RAPD、4条ISSR和2对SRAP引物适合姬松茸菌株鉴定分析,3种标记方法均将16个菌株分为3大类群,A0011+1和A0013为1类,A0009单独为1类,其余菌株为1类。3种分子标记法对姬松茸菌株鉴别的结果存在着一定差别。SRAP反应的遗传信息较丰富,比ISSR、RAPD检测到更大的遗传差异;RAPD引物扩增到的多态性条带数较多。     

百山祖冷杉SSR体系的建立及人工辅助授粉子代的初步鉴定

应用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取百山祖冷杉Abies beshanzuensis叶片DNA,建立百山祖冷杉简单重复序列（SSR）反应体系。在体系建立过程中,采用单因素法分别对影响聚合酶链反应（PCR）的因素进行分析。结果表明：在20.00 μL反应体系中,模板DNA用量、镁离子（Mg²⁺）浓度、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量分别是60 ng,3.75 mmol·L^－1,0.15 mmol·L^－1,0.40 μmol·L^－1,16.67 nkat（1.0 U）时结果最好。随机挑取其中1对引物扩增的多态性片段进行克隆测序,序列经比对后得到的一致性值达到94%,表明其他杉科植物的SSR引物可以在百山祖冷杉中应用。通过引物筛选,得到15对引物可在百山祖冷杉中扩增得到多态性条带,其中4对引物扩增得到的部分片段在百山祖冷杉和日本冷杉Abies firma间有明显区别。这些结果表明,利用SSR分子标记技术能够用于百山祖冷杉人工辅助授粉子代的初步鉴定。图7表2参16     

减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立

根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μm01·L-1,内引物浓度0.8 μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 ...