产蛋白酶海洋细菌的筛选及产酶工艺优化

[目的]筛选产蛋白酶的海洋细菌资源。[方法]分别采用2216E培养基和酪蛋白固体培养基,对采自宁波洋沙山和象山海域的海水进行微生物的分离与纯化,采用平板透明圈法初筛和酶活力测定法复筛,采用16S r DNA序列分析进行菌株鉴定,并进行产酶工艺优化研究。[结果]纯化出15株产蛋白酶海洋细菌,从中筛选出1株产蛋白酶活力最高的菌株PB02,经鉴定为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。该菌株最适培养温度为20℃,最适装液量为10%,最适接种量为0.5%,最适转速为100 r/min,最适培养基pH为7。酶促反应最适温度为40℃,最适pH为10。[结论]该研究为蛋白酶高产菌株的改造和定向进化奠定了资源基础。     

北极海洋沉积物可培养细菌多样性及抗植物病原真菌活性菌株筛选

根据菌落形态特征,从中国第4次北极科考采取的海洋沉积物BN05中分离到19株细菌,对其进行分子鉴定与系统发育分析,并利用平板扩散法从中筛选出对植物病原真菌尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)具有明显抑制作用的活性菌株。分子鉴定与系统发育分析表明,从北极海洋沉积物中分离到的细菌主要为γ-变形杆菌纲(γ-Proteobacteria),分别属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter);1株属于放线菌门(Actinobacteria)的节杆菌属(Arthrobacter)。假交替单胞菌属是北极海洋沉积物BN05中可培养细菌中的优势菌群。活性菌株筛选结果表明,5株菌株对尖刀镰孢菌具有明显的抑制作用,其中菌株BN05-S-2和BN05-B-6属于假单胞菌属,菌株BN05-M-2、BN05-M-7和BN05-B-2属于假交替单胞菌属。     

不产氧光合细菌分离鉴定及其产氢菌株的快速筛选

为建立产氢不产氧光合菌株的快速筛选方法,从采自陕西、河南、安徽3个省8份不同水样中分离出的不产氧光合细菌,通过菌落形态、革兰氏染色、细菌特征峰及16SrDNA鉴定等方法进行初步鉴定获得不产氧光合细菌,同时利用自制的产氢菌株快速筛选系统对其产氢能力进行检测,并分析菌液终点氧化还原电位与细胞产氢的关系。结果表明:共分离得到31株光合细菌,其中18株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、5株荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、4株球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和2株固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans),此外还有2株菌与Rhodobacter sp.TCRI 14相似。这些光合细菌的产氢能力存在显著差异,其中3株产氢性能较高,2株为沼泽红假单胞菌,1株为球形红细菌。通过菌液终点氧化还原电位与细胞产氢能力对比,发现产氢较高的菌株其菌液的终点氧化还原电位也明显较低。     

产细菌素乳酸菌的筛选及细菌素相关基因的分析

试验利用溶钙圈法及牛津杯双层平板法,从国内外优良发酵肉品中分离筛选产细菌素的乳酸菌,通过形态学、生理生化学鉴定,16S rDNA及种间特异性基因PCR扩增将菌株鉴定到种,并对其细菌素相关基因进行分析,初步确定细菌素种类.结果表明:在排除有机酸、过氧化氢等干扰因素后,从分离纯化到的92株乳酸菌中筛选到一株对指示菌仍有明显抑制作用的菌株L-ZS9,该菌株所产抑菌物质对蛋白酶(酸性蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶)敏感,而α-淀粉酶对其活性基本无影响,因而确定L-ZS9为细菌素产生菌.经鉴定L-ZS9为类植物乳杆菌,进一步对菌株细菌素相关基因进行PCR扩增表明,L-ZS9含有Ⅱb类细菌素Plantaricin EF,Plantaricin JK,Ⅱc类细菌素Plantaricin A及Plantaricin N基因编码序列,此外plnE、plnF、plnJ和plnK的序列分析结果显示,plnF和plnK的成熟肽序列与Lactobacillus plantarum C11 (X94434)相应的细菌素成熟肽序列完全相同,plnE和plnJ的成熟肽序列仅出现一处氨基酸突变,因而确定类植物乳杆菌L-ZS9为天然的多种细菌素产生菌.     

畜禽粪污土壤中产纤维素酶细菌的筛选及鉴定

从畜禽养殖场土壤中分离到细菌菌株87株,初筛到26株具有产纤维素酶能力的菌株,通过复筛,获得2株产纤维素酶能力较好的菌株。根据形态特征观察、16S rDNA序列分析及生理生化特征测定,鉴定产酶细菌L2、L3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

一株产低温蛋白酶芽胞杆菌FJAT-24893的筛选与鉴定

为了解西藏尼玛县甲热布错湖及其周边土壤的微生物多样性,研究低温蛋白酶的高效生产生物技术,采用温度梯度法和稀释法,NA平板涂布分离可培养芽胞杆菌,通过酪素培养基筛选产蛋白酶的耐低温菌株,对甲热布错湖耐低温菌进行分离,并对其中的产低温蛋白酶菌株进行筛选,分析分离菌株生理生化特征、最适产酶条件,结合16SrRNA基因序列同源性分析确定产低温蛋白酶菌株的多样性和系统进化地位。从获得的16株分离物中筛选到1株产低温蛋白酶芽胞杆菌菌株FJAT-24893,经16SrRNA鉴定为耐寒芽胞杆菌(Bacillus frigoritolerans)。该菌株最适产酶温度为25℃、最适pH为8。     

广西北部湾近海产胞外多糖细菌多样性及其抗氧化活性分析

[目的]鉴定广西北部湾近海产胞外多糖(EPS)的海洋细菌种类多样性,并测定其EPS生物学活性,为后续研究EPS活性及其开发利用打下基础.[方法]采用黏液比色法、乙醇沉法和苯酚硫酸法初筛产EPS细菌,通过16S rD-NA序列鉴定细菌种属并进行遗传进化分析,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)测定EPS的抗氧化活性.[结果]从广西北部湾近海海水、沙粒和红树林泥土中共分离出205株产EPS细菌,结合分离株的菌落特征和形态观察结果可将所分离获得的细菌归为28种细菌.对28株代表细菌株进行鉴定,结果显示分属于2个纲(芽孢杆菌纲和γ-变形菌纲)、4个目(芽孢杆菌目、假单胞菌目、弧菌目和肠杆菌目)、4个科(芽孢杆菌科、莫拉菌科、弧菌科和肠杆菌科)、6个属(芽孢杆菌属、葡萄球菌属、弧菌属、发光杆菌属、变形杆菌属和不动杆菌属)、15个种;优势菌属为芽孢杆菌属,占所鉴定菌株的71.43%,其次为葡萄球菌属、弧菌属、发光杆菌属、变形杆菌属和不动杆菌属.EPS活性检测结果显示,不同种属细菌所产EPS均具有一定的DPPH清除作用,但不同菌株间差异明显,清除率为9.43%~71.10%.[结论]从广西北部湾近海地区共分离鉴定出2纲4目4科6属15种产EPS的海洋细菌,以芽孢杆菌属为主,存在种类多样性,且各类细菌分泌产生的EPS均具有一定抗氧化活性.     

Domiati奶酪中抗黄曲霉毒素活性物质产生菌的分离鉴定及其抑菌作用

通过抑菌活性试验、蛋白酶敏感性试验、菌株的动力学生长曲线测定,菌株的生理生化试验以及1 6S rRNA序列鉴定试验,对埃及传统Domiati奶酪中的产抗黄曲霉毒素的活性物质的菌株进行分离与鉴定.结果显示:分离得到的菌株的发酵上清液对多株受试真菌均有明显抑制作用,尤其对产生黄曲霉毒素的黄曲霉(Asper-gillus flauus)有很强的抑制效果;该菌株产生的抑菌活性物质不是蛋白类物质,也不同于一般细菌素;该菌鉴定为扩展短杆菌(Brevibacterium linens),命名为lpl-8菌.     

番茄土传病害拮抗菌的筛选和鉴定（英文）

[目的]筛选出对番茄土传病有防治效果的生防菌。[方法]该研究以番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)为靶标菌,利用梯度稀释涂板法和平板对峙生长法从土样中分离、筛选出分别对这2种病原菌具有较强抑制作用的拮抗细菌;并对其抑菌谱及代谢分泌物进行测定,运用Neighbor-Joining方法构建系统发育树,对拮抗细菌进行种属鉴定。[结果]从60份土样中分离出对番茄青枯病菌有拮抗作用的细菌59株,其中抑菌圈直径25 mm的有10株;对番茄枯萎病菌有拮抗作用的细菌30株,其中抑制率30%的有4株。上述14株菌株中,N23-2、N58-2、NF59-3、NF61-1对多种病原细菌和病原真菌皆具有较好的拮抗作用;产纤维素酶的菌株有12株,产蛋白酶的菌株有11株,产嗜铁素的菌株有6株。种属鉴定结果表明:有4株属多粘芽孢杆菌(Paenibacillus),3株属链霉菌(Streptomyces),3株属假单胞菌(Pseudomonas),4株属芽孢杆菌(Bacillus)。[结论]该研究结果为番茄土传病害的生物防治提供更多的微生物资源。     

藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性、产酶潜力及拮抗活性,为开发利用相关资源提供参考。【方法】从藏北高寒草原盐碱地采集22份土样,用平板稀释法从中分离放线菌,进行初步的形态鉴定后得到有代表性的36株耐碱放线菌,对这些代表性菌株的16SrRNA基因序列进行系统发育分析,将这些菌株鉴定到属;采用生长速率法测定分离菌株发酵液对1种细菌和4种农作物真菌的抑菌活性,并对分离株菌进行纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活初筛,分析其拮抗活性。【结果】从22份土样中分离到有代表性的36株耐碱放线菌;16SrRNA基因序列分析表明,这36株菌分布于放线菌门放线菌纲5个亚目5个科的5个属,即链霉菌属(Streptomyces)、糖丝菌属(Saccharothrix)、小单孢菌属(Micromonospora)、原小单孢菌属(Promicromonospora)和韩国生工菌属(Kribbella);分离菌株中25.0%具有纤维素酶活性,8.3%具有淀粉酶活性,16.6%具有蛋白酶活性。所得耐碱放线菌中33.3%的菌株有抑菌活性,其中有5株具有高拮抗活性(抑菌圈直径≥20mm),分别是J10、J14、J21、J48和J65。【结论】藏北高寒草原盐碱地生境蕴藏着丰富的耐碱放线菌资源,这些耐碱放线菌具有高酶和拮抗菌活性。     

生防菌株对地黄枯萎病的防治效果及其促生作用

从地黄根际土壤中分离到对地黄枯萎病菌有较强抑制作用的B6、B2 1、S15、S5 2、S72、S92、S95、T3和T4等9株生防菌。经盆栽试验和田间小区防治试验,结果表明,S15、S72、S5 2、B6和T4对地黄枯萎病的防效都达到了5 0 %以上,且S5 2、S15和S95对地黄具有明显的促生增产作用,具有较好的开发利用价值。     

链霉菌对玉米弯孢霉菌抑制作用的初步研究

用 39株链霉菌株对玉米弯孢霉菌进行了拮抗作用的研究。结果表明 ,有 7株对玉米弯孢霉菌表现一级拮抗作用 ,15株表现二级拮抗作用 ,17株没有表现拮抗作用。其中E17-P、B17-G菌株的抑菌效果达到福美双5 μL·L-1稀释液作用的 6 0 %以上 ,并且超过了退菌特 5 μL·L-1稀释液的作用 ,是较好的具有潜力的生防菌。同时 ,所有一级拮抗菌的抑菌稳定性都好于杀菌剂对照     

亚洲柑橘木虱2株高致病力病原真菌菌株的筛选

【目的】筛选对亚洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama具有高致病力的真菌菌株,为其微生物农药的研发奠定基础。【方法】测定5株球孢白僵菌Beauveria bassiana(菌株A~E)和5株玫烟色棒束孢菌Isaria fumosorosea菌株(菌株A~E)的生长速率、产孢量以及对木虱若虫的侵染致死率等,并进行比较分析。【结果】5株球孢白僵菌培养10 d后产孢量存在较大差异,A菌株的产孢量最少(7.96×107mL~(-1)),E菌株的产孢量最多(3.78×108mL~(-1)),两者差异显著;在喷施球孢白僵菌孢子1×106mL~(-1)7 d后,对柑橘木虱低龄若虫的致死率与对照差异不显著,以A菌株的致死率最高(78.0%),E菌株次之(77.0%)。5株玫烟色棒束孢菌株培养10 d后,B菌株产孢量最多(6.04×108mL~(-1)),E菌株的最少(6.28×107mL~(-1)),两者差异显著;在喷施玫烟色棒束孢孢子1×106mL~(-1)7 d后,除D菌株外,其他制剂对亚洲柑橘木虱低龄若虫的致死率均显著大于对照,B菌株的致死率最高(81.0%)。【结论】综合考虑产孢量及致病力等指标,球孢白僵菌E菌株和玫烟色棒束孢B菌株是具有良好研发前景的柑橘木虱生物防治高致病力优良菌株。     

耐受甲醛并能利用甲醇细菌的分离及其基因组文库的构建

从污水样品筛选出能利用甲醇的菌株A和B,经16S rDNA测序分析,鉴定为芽孢杆菌(Bacillussp.KM01)和肺炎克氏杆菌(Kleb-siella pneumoniae)。甲醛耐受能力的测试表明,这两种分离菌对甲醛具有较强的耐受能力,能在含8~15 mmol/L甲醛的LB培养基上生长。Southern杂交分析结果说明,这两株菌的基因组中有兼性甲基营养菌6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)基因的同源序列。以pUC118为载体构建了这两种分离菌的基因组文库,进一步的检测结果说明所构建的基因组文库质量符合要求。     

鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco “红头病”病原---鮰爱德华菌 Edwardsiella ictaluri A86为抗原,利用杂交瘤技术制备了鮰爱德华菌黄颡鱼分离株的菌体单抗5D11、1B8、1G7、3G8、5A9、3H8,其效价分别为1：1280、1：1280、1：2560、1：320、1：160和1：80。结果表明：6株单抗与11株鮰爱德华菌黄颡鱼分离株均可以结合,与迟缓爱德华菌、气单胞菌、大肠杆菌、链球菌、弧菌等10株参考菌株均无交叉反应,单抗5D11和1B8可与鮰爱德华菌参考菌株结合。应用免疫荧光和免疫组织化学法检测了鮰爱德华菌对黄颡鱼的侵染规律。结果表明：黄颡鱼经人工注射鮰爱德华菌A86感染6 h后,在其肝、肾、脾、心、肠和胃中检测到了阳性细菌,其中脾脏中最多,心脏中最少;感染24 h后,脑中检测到阳性细菌;30 h后,鳃中显示有阳性信号;54 h后,在眼的外边缘检测到少量阳性细菌。研究结果可为进一步研究鮰爱德华菌在黄颡鱼体内的致病机理提供技术手段及基础,对揭示黄颡鱼“红头病”的发病机制具有重要意义。     

产蛋鸡卵黄性腹膜炎病原分离鉴定及防制试验

从25个鸡场疑似卵黄性腹膜炎的病料中分离到了18株大肠杆菌和2株沙门氏菌,经大肠杆菌O血清型鉴定为O_(78)6株,O_(11)、O_4各4株,O_(143)2株,O_(15)、O_2各1株,其中O_(78)、O_(11)、O_4为优势血清型,用优势血清型菌株分别接种改良的血清-葡萄糖-肉汤培养基研制成多价油乳剂灭活苗,在开产前接种鸡群预防产蛋鸡卵黄性腹膜炎,预防效果良好,而采取多价油乳剂灭活苗预防接种配合活菌制剂益生素使用,预防效果更佳。使用优势血清型菌株筛选的敏感药物硫酸丁胺卡那霉素、强力霉素,同时配合清瘟败毒散和V_C对卵黄性腹膜炎鸡群进行治疗,治疗效果良好。     

鸡致病性大肠杆菌耐药性检测

从河南省4个地市（区）商品肉鸡病料中分离了15株大肠杆菌（E．coli）,在对其进行生化鉴定的基础上,采用微量倍比稀释法测定了17种抗菌药物对它们的体外最小抑菌浓度（MIC）,并按照美国临床实验标准化委员会（NCCLS）的抗菌药物敏感性标准（2009年第十九版）进行耐药性判断和耐药谱比较分析。结果显示：15株鸡E．coli对17种抗菌药物中的16种药物均有不同程度的耐药性,其中对头孢唑林、恩诺沙星、新霉素、环丙沙星的耐药性比例达90％～100％,对阿莫西林、头孢曲松、庆大霉素、阿奇霉素的耐药性比例达到80％以上,对多西环素、大观霉素、左氧氟沙星的耐药性比例达到60％以上。17种抗菌药物敏感性比例达到60％以上的有多粘菌素B、阿米卡星、氟苯尼考,其余药物的敏感性比例均在40％以下。15株鸡E．coli均为多重耐药菌株,耐药谱最多的药物达到14种,耐药谱最少的药物有6种。说明鸡E．coli对常用抗菌药物已产生比较普遍的耐药性,而且耐药谱较宽。     

寄生松墨天牛的球孢白僵菌不同菌株DNA多态性的RAPD 分析

采用RAPD 技术对21 个不同来源的寄生松墨天牛Monochamus alternatus 的球孢白僵菌Beauveria bassiana 菌株的DNA 指纹图谱进行了测定。从RAPD 结果可知寄生松墨天牛的白僵菌菌株间具有丰富的遗传多态性。聚类分析把21 个寄生松墨天牛的白僵菌菌株分为两大类群:①B1 , B14 , B4 , B5 , B6 , B7 , B8 , B12 , B13 , B10 , F-263 , Bxs , B2 , B11 , Bf , Bz , B9 ;②B3 , B15 , By2 , By7 。结果表明菌株DNA 多态性与采集地之间有一定的相关性, 与对松墨天牛幼虫的毒力未表现出相关性。图2 表2 参11     

Effect of Inoculation Rhizobium and Response of Soybean-Rhizobium System to Insoluble Phosphate

In order to produce efficiently symbiotic system in acid soils which could be used for the recovery of insoluble phosphate soil and improvement of the fertility,etc.,host range of Rhizobium was isolated from the root nodules of wild and cultivated soybean varieties growing in south China,evaluated the effects of Rhizobium on enhance nitrogen fixing activities,phosphorus(P),nitrogen (N)uptakes,growth and yield of soybean under pot and field conditions.The results showed that combined Rhizobium inoculation was more effective than individual Rhizobium inoculation. The combined Rhizobium of CW54 strains had the highest effect, nodule number, nodule weight and nodule nitrogenase activity were markedly stimulated as compared to those of the control U110, respectively. The nitrogen contents in the plants treated with CW54 strains were significantly increased by 43.2% as compared to those of the control U110 in Al-P soil, but statistical significance was not observed in Fe-P soil. By contrast, inoculation with CW54 significantly enhanced phosphorus uptake of plant in Fe-P soil than that in Al-P soil. The effects of inoculation of CW54 strains in a field condition were similar to those of in a pot condition. The total biomass and yield in the plants treated with CW54 strains were significantly increased by 86.4% and 51.4% as compared to those of the control at the time of soybean podding in a field condition, respectively.These results suggested that inoculation Rhizobium was beneficial for soybean nutrient uptake,growth and yield under insoluble phosphate soil conditions.     

红壳色中华绒螯蟹仔蟹养殖方式研究

为探讨养殖方式对红壳色不同家系中华绒螯蟹Eriocheir sinensis仔蟹生长的影响,采用室内群体养殖、室内单体养殖和室外稻田养殖3种方式,比较了红壳色(A)、红壳家系中正常壳色(B)、"光合1号"(C),以及拟建立的早熟(D)、近亲早熟(E)育种家系仔蟹的生长特征。结果表明:室内群体养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为35.8%,仅与D组有显著性差异(P0.05);A组仔蟹头胸甲宽的变异系数(CV)为27%,个体大小差异较小,与其余组间有显著性差异(P0.05);A组仔蟹体质量特定生长率(SGR)为7.0%/d,各组间无显著性差异(P0.05)。室内单体养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为86.7%,显著高于B、E组(P0.05);A组仔蟹头胸甲宽的CV为52%,个体大小差异较大,与C、D组有极显著性差异(P0.01);A组仔蟹体质量SGR为5.7%/d,A组与B、C、E组仔蟹生长差异明显(P0.05)。室外稻田围隔养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为3.2%,极显著低于B、C、D组(P0.01);A组仔蟹头胸甲宽的CV为12%,极显著低于E、D组(P0.01);A组仔蟹体质量SGR最低,为8.1%/d,各组间无显著性差异(P0.05)。研究表明,室内单体养殖红壳色仔蟹能显著提高其成活率,有助于获得更多育种家系相关性状的信息。