IL-15过表达对猪骨骼肌细胞成肌分化的影响

【目的】研究肌肉因子IL-15（interleukin 15）对猪骨骼肌成肌细胞增殖与凋亡的影响,为进一步研究IL-15在动物肌肉品质调控和骨骼肌疾病治疗提供依据。【方法】构建IL-15过表达慢病毒载体GV-492-IL-15,体外无菌分离培养猪骨骼肌卫星细胞,诱导分化,并通过免疫荧光染色进行成肌细胞验证。将成肌细胞转染IL-15过表达重组慢病毒载体,试验分别设置空白对照组（Control）、转染阴性对照病毒组（IL-15-）和转染GV-492-IL-15（IL-15+）慢病毒试验组（n=3）。培养72 h后,收集细胞和培养上清液。分别采用实时定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot技术分析目的基因和蛋白的表达情况,采用ELISA试剂盒分析培养液中IL-15含量,采用CCK-8试剂盒分析成肌细胞活力,采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,采用Western Blot技术检测与细胞凋亡密切相关的caspase-3蛋白表达水平的变化。【结果】（1）经鉴定后的质粒转染293T细胞,细胞内可观察到明显的绿色荧光,经Western Blot检测,可以观察到20 kD附近处有特征条带;（2）分离培养的猪骨骼肌卫星细胞呈梭形或纺锤形,诱导后可分化为呈管状的成肌细胞。将分化后的成肌细胞,进行α-SMA单克隆抗体免疫荧光染色,视野中90%的细胞呈阳性反应,胞浆染成红色,表明细胞为骨骼肌成肌细胞。（3）转染GV-492-IL-15慢病毒后,与对照细胞组相比,成肌细胞内IL-15 mRNA和蛋白相对表达量均极显著升高（P<0.001）,但培养液中IL-15蛋白水平变化不大（P>0.05）。CCK-8结果显示,过表达IL-15可增强细胞的增殖能力（P<0.05）。与对照组相比,转染GV-492-IL-15慢病毒的细胞早期凋亡率差异不显著（P>0.05）,但细胞晚期凋亡率显著下降（P<0.05）。与对照组相比,转染慢病毒组细胞中caspase-3蛋白有下降的趋势,但差异不显著（P>0.05）。此外,转染IL-15过表达慢病毒可使G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）。【结论】在正常生理条件下,IL-15是定位在细胞内并发挥作用的,IL-15过表达对猪骨骼肌成肌细胞早期凋亡没有显著影响,但可以抑制其晚期凋亡,并促进细胞增殖。这一研究将为IL-15正向调控猪骨骼肌肌肉品质和治疗相关肌肉疾病提供技术和理论依据。     

饲粮添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能与瘤胃发酵的影响

【目的】研究饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能和瘤胃发酵的影响,为酿酒酵母和地衣芽孢杆菌在肉羊饲粮中的合理应用提供理论依据。【方法】试验选用48只4月龄、体重相近（22.96±2.00）kg、健康的杜泊×小尾寒羊杂交F₁代公羔,根据饲喂添加剂不同随机分为4组：D（对照组,两种菌均不添加）;D1（酿酒酵母,6×10¹⁰CFU/kg）;D2（地衣芽孢杆菌,2×10¹⁰CFU/kg）;D3（酿酒酵母6×10¹⁰CFU/kg+地衣芽孢杆菌2×10¹⁰CFU/kg）,每组12只羊,试验期共75 d,前15 d为适应期,正饲期60d。试验羊每天分别于08:00和18:00进行饲喂,自由采食和饮水。正饲期内每天准确称量记录每只试验羊的喂料量和剩料量,并在第1、30、60 天晨饲前对试验羊进行称重,计算平均日采食量、平均日增重（ADG）及料重比（F/G）。试验结束当天08：00正常饲喂试验羊,3 h后采集瘤胃液,测定发酵参数、消化酶活性以及功能微生物。【结果】1）饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对试验羊的初始体重和终末体重及平均采食量的影响均不显著（P>0.05）,D3组的ADG显著高于D组（P<0.05）,D3组的F/G显著低于D组（P<0.05）,D1和D2组的F/G差异不显著（P>0.05）;2）饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对瘤胃液pH、丁酸浓度及乙丙比的影响均不显著（P>0.05）,D3组的NH₃-N浓度显著低于D组（P<0.05）,TVFA和丙酸浓度显著高于D组（P<0.05）,且D3组与D1和D2组均差异不显著（P>0.05）,D3和D2组的乙酸浓度显著高于D1与D组（P<0.05）;3）D3组的β-葡萄糖苷酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶及淀粉酶活性均显著高于其他3组（P<0.05）。D1和D2组的β-葡萄糖苷酶、果胶酶、羟甲基纤维素酶及淀粉酶活性与D组无显著差异（P>0.05）。D3组蛋白酶活性显著高于D和D2组（P<0.05）,与D1组差异不显著（P>0.05）,D1和D2组的β-葡萄糖苷酶、果胶酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶及淀粉酶活性均差异不显著（P>0.05）;4）添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对黄色瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、嗜淀粉瘤胃杆菌和原虫数量的影响不显著（P>0.05）,D3组的溶纤维丁酸弧菌数显著高于其他3组（P<0.05）,白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌显著高于D组（P<0.05）,但与D1和D2组差异不显著（P>0.05）。与对照组相比,试验组产甲烷菌数量显著降低（P<0.05）,其中D3组最低。【结论】饲粮中添加6×10¹⁰CFU/kg酿酒酵母和2×10¹⁰CFU/kg地衣芽孢杆菌均会对绵羊瘤胃发酵产生积极影响,提高了瘤胃消化酶的活性,增加了瘤胃有益菌的数量,且二者组合饲喂效果更加显著。     

相对饲养水平对绵羊肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响

【目的】提高肉品质是现代肉羊生产的主要目标之一,研究不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响,为通过饲养水平调控肉脂型绵羊肉品质,提高生产效益提供参考。【方法】选择出生日龄接近（（3.0±0.5）月龄）、体况良好、体重相近（（19.16±0.54）kg）、臀型一致的阿勒泰羊30只,随机分为3组,自由采食60 d后,分别按照50%（0.25 MJ/W^0.75×d^-1）（NL组）、100%（0.5 MJ/W^0.75×d^-1）（NM组）、150%（0.75 MJ/W^0.75×d^-1）（NH组）的维持代谢能饲喂30 d后屠宰,取背最长肌分别进行苏木精—伊红(H.E.)染色和2%醋酸铀-枸橼酸铅双染色法染色,光学显微镜和透射电镜观察肌肉组织结构,并通过免疫组化法测定肌球蛋白重链I (myosin heavy chain,MyHC I)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（preoxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）蛋白表达量。【结果】(1) 阿勒泰羊摄入50%、100%和150%的维持代谢能时,三组试验羊的平均日增重分别为-90.67 kg、13.33 kg和203.00 kg,差异显著(P<0.05);背最长肌肌纤维直径NH组、NM组显著大于NL组（P<0.05）;肌内膜厚度NH组显著小于NL组（P<0.05）;肌束肌纤维数量、肌束纤维面积、肌束膜厚度以及肌纤维面积、肌纤维密度差异不显著（P>0.05）。(2) 饲养水平对肌质网终池面积、脂滴面积以及肌质网终池、肌原纤维、肌质的面积比都有影响,肌质网终池面积和面积比NH组显著大于NM和NL组（P<0.05）,脂滴面积NH组显著大于NL组（P<0.05）;肌质面积比NM组显著大于NH和NL组（P<0.05）;线粒体、糖原三组之间无显著差异（P<0.05）。(3) 饲养水平对肌纤维组成相关基因蛋白的表达有影响,PPARγ的蛋白表达强度、阳性面积和阳性率NL和NM组显著低于NH组（P<0.05）;MyHCⅠ蛋白表达强度随能量摄入水平的增加而增大,但是三组间差异不显著（P>0.05）。【结论】不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌肉组织结构和肌纤维类型相关基因蛋白的表达具有显著的影响,在育肥期可通过饲养水平控制肌肉组织结构和肌纤维类型组成,从而按照生产需要调控肉品质。     

葡萄籽原花青素对羔羊瘤胃发酵、血清炎症及抗氧化指标的影响

【目的】研究高精料饲粮条件下,添加不同水平葡萄籽原花青素（GSPs）对杜寒杂交羔羊生长性能、瘤胃发酵、瘤胃及血清炎症因子及抗氧化能力的影响。为葡萄籽原花青素在反刍动物生产中的应用提供数据参考。【方法】选择48只体重相近（22.75±1.20 kg）、月龄相近的杜泊×小尾寒羊杂交公羔,采用单因素完全随机试验设计,将48只羔羊随机分为4组,每组12只。基础饲粮精粗比为7:3,GSPs添加量分别为0（对照组,CON）、10（10GSPs）、20（20GSPs）、40（40GSPs）mg·kg^-1 BW。饲养期共60 d,前15 d为预饲期。正试期第1天晨饲前称量体重作为初始体重。正试期结束后颈静脉采集血液并分离血清,用于抗氧化指标、炎性因子和脂多糖含量测定;同时每组随机选择6只分别于饲喂后1、3、4、6、8、12 h口腔采集瘤胃液,立即测定瘤胃液pH,饲喂后3 h瘤胃液样品用于测定发酵指标及脂多糖含量。每组剩余6只进行屠宰,采集瘤胃组织测定抗氧化指标和炎症因子水平。【结果】10GSPs和20GSPs组的末体重显著高于对照组（P<0.05）,与40GSPs组差异不显著（P>0.05）。10GSPs和20GSPs组ADG和ADFI显著高于对照组和40GSPs组（P<0.05）,而40GSPs组与对照组差异不显著（P>0.05）;添加GSPs对瘤胃pH有一定的调控作用,饲喂后3、8、12 h瘤胃pH随GSPs添加水平增加而线性升高（P<0.05）,4 h瘤胃pH较对照组有线性升高趋势,但差异不显著（P=0.057）;添加GSPs后瘤胃液中乙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度有降低的趋势（P<0.1）,对丙酸、异戊酸、戊酸浓度及乙酸/丙酸值没有显著影响（P>0.05）;添加GSPs后血清脂多糖浓度较对照组显著降低（P<0.05）,但不影响瘤胃液中脂多糖浓度。20GSPs和40GSPs组瘤胃组织GSH-Px活性显著高于对照组和10GSPs组,MDA含量显著低于对照组和10GSPs组（P<0.05）。20GSPs和40GSPs组血清SOD活性显著高于对照组,GSH-Px活性显著高于对照组和10GSPs组（P<0.05）。添加GSPs对瘤胃组织炎症因子没有显著影响,但有降低IL-6和IL-10的趋势（P<0.1）。20GSPs和40GSPs组血清TNF-α水平显著低于对照组和10GSPs组（P<0.05）;40GSPs组血清IL-10含量显著低于对照组（P<0.05）,与10GSPs和20GSPs组差异不显著（P>0.05）。【结论】高精料饲粮条件下补饲适量GSPs可以提高羔羊瘤胃pH,提高血清和瘤胃组织抗氧化能力,对羔羊健康具有潜在的保护效应。在本试验条件下,GSPs的最佳饲喂量为20 mg·kg^-1BW。     

日粮中添加小肽对育肥牦牛生产性能和消化道PepT1 mRNA表达的影响

【目的】研究日粮中添加小肽对育肥牦牛生产性能、养分表观消化率、血液指标及消化道小肽转运载体1（PepT1）mRNA表达的影响,为小肽在牦牛日粮中的合理应用提供数据支持。【方法】选取36头体重（（180.98±20.57）kg）相近,健康的麦洼公牦牛,按照随机区组试验设计分为4组,每组9个重复,每个重复1头牛。分别饲喂小肽添加水平为0、0.75%、1.50%、2.25%的全混合日粮。预饲期30 d,正试期80 d。试验开始和结束时记录体重,每日饲喂时记录每头牦牛的喂料量及剩料量。试验最后一周,连续3 d收集每头牦牛的饲料及粪便样品,进行常规营养分析;同时,每组选取5头牦牛采集颈静脉血并制备血清,测定血清生化及免疫指标。试验结束后,将每组采血的5头牦牛屠宰,立即取瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃及十二指肠、空肠、回肠组织,通过实时荧光定量PCR法测定各组织中PepT1 mRNA的表达量。【结果】（1）平均日增重（ADG）、干物质采食量（DMI）和料重比（F/G）随小肽添加水平的升高均呈二次曲线变化（P<0.05）,以2.25%组牦牛的生产性能表现最优,其DMI和ADG均显著高于对照组和0.75%组（P<0.05）,而F/G显著低于对照组和0.75%组（P<0.05）。（2）随小肽添加水平的升高,日粮有机物（OM）和粗蛋白（CP）的表观消化率呈二次曲线上升（P<0.05）,中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的表观消化率线性升高（P<0.01）,以2.25%组消化率最高;各处理组中钙、磷的表观消化率无显著差异（P>0.05）。（3）随小肽添加水平的升高,血清中谷丙转氨酶（ALT）含量线性降低（P<0.05）,而尿素氮（UN）含量线性升高（P<0.05）,总蛋白（TP）含量有线性升高的趋势（P<0.10）,谷草转氨酶（AST）含量呈二次曲线降低（P<0.05）,而碱性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（GLU）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）含量未产生显著变化（P>0.05）;日粮中添加不同水平小肽对牦牛血清中IgG、IgA和IgM三种免疫球蛋白的含量均无显著影响（P>0.05）。（4）牦牛消化道中PepT1 mRNA表达量由高到低依次为空肠、回肠、十二指肠、网胃、瓣胃、瘤胃、皱胃,且空肠PepT1 mRNA的表达量显著高于其他消化道部位（P<0.05）,而皱胃PepT1 mRNA的表达量显著低于空肠和回肠（P<0.05）;回肠、十二指肠、瘤胃、网胃、瓣胃的PepT1 mRNA表达量无显著差异（P>0.05）。随小肽添加水平的升高,瘤胃、网胃和空肠的PepT1 mRNA表达量均呈线性升高变化（P<0.05）,但对瓣胃、皱胃、十二指肠和回肠的PepT1 mRNA表达量均无显著影响（P>0.05）。【结论】日粮中添加小肽能够提高育肥牦牛的生产性能和养分表观消化率,改善肝功能,促进小肽在消化道中的转运吸收。在本试验条件下,日粮小肽添加水平为2.25%时饲喂效果最佳。     

姜黄素通过Nrf2信号通路对H2O2诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的缓解

【目的】验证姜黄素是否能够通过转录因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）信号通路减轻H₂O₂诱导的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激,为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的氧化损伤提供理论依据。【方法】培养奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,用500 μmol·L^-1H₂O₂处理MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L^-1）处理3 h;MAC-T细胞转染Nrf2 siRNA 48 h后,用500 μmol·L ^-1 H₂O₂处理奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L^-1）处理3 h。采用实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和试剂盒等方法,检测Nrf2的蛋白表达量及下游靶基因NAD（P）H醌氧化还原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1）和血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）的mRNA及蛋白表达量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等氧化应激相关指标的活性及含量。【结果】（1）H₂O₂处理组MAC-T细胞中MDA含量显著高于对照组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著低于对照组（P<0.01）。15 μmol·L^-1姜黄素+H₂O₂共同处理组和30 μmol·L^-1姜黄素+H₂O₂共同处理组MAC-T细胞中MDA的含量显著低于H₂O₂处理组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著高于H₂O₂处理组（P<0.05,P<0.01）。（2）H₂O₂处理组总Nrf2蛋白水平显著低于对照组（P<0.01）,H₂O₂处理组Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著低于对照组（P<0.01）。姜黄素处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）,姜黄素处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于对照组（P<0.01）。姜黄素+H₂O₂处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于H₂O₂处理组（P<0.01）,姜黄素+H₂O₂处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于H₂O₂处理组（P<0.01）。（3）si-Nrf2组与对照组相比,Nrf2的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。si-Control+H₂O₂+姜黄素组与si-Control+H₂O₂组相比,MDA的含量显著降低（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著升高（P<0.01）。si-Nrf2+H₂O₂+姜黄素处理组与si-Control+H₂O₂+姜黄素组相比,MDA的含量显著升高（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.01）。【结论】姜黄素可以通过增加Nrf2的表达,诱导下游抗氧化分子的转录从而缓解H₂O₂诱导奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激。本研究为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤提供理论依据。     

大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

【背景】大豆异黄酮主要包括染料木素和大豆苷元,发挥类雌激素样作用,能够清除自由基,促进细胞增殖。颗粒细胞是卵泡内重要的细胞群体,其生理状态与卵巢功能直接相关。颗粒细胞凋亡常引起卵泡闭锁。牦牛是青藏高原特有物种之一,但其繁殖率低,其具体机制尚不明确。卵巢颗粒细胞是研究雌性动物生殖调控机制的理想细胞模型。【目的】探讨大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,为大豆异黄酮的作用机制研究提供依据。【方法】分离培养牦牛卵巢颗粒细胞,FSHR免疫细胞化学染色鉴定,MTT法测定细胞增殖情况,绘制生长曲线;细胞传代后添加不同浓度染料木素或大豆苷元（0,1 000,2 000,3 000,4 000和5 000 pg·mL^-1）,选择染料木素或大豆苷元最佳作用浓度分别处理二代颗粒细胞48 h,收集细胞培养液,ELISA法检测培养液中雌二醇（E₂）和孕酮（P₄）浓度;同时收集细胞,提取总RNA,实时荧光定量PCR法检测细胞增殖相关基因AKT1和细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bad、Fas、FasL、Caspase-3和p53的表达水平。【结果】牦牛卵巢颗粒细胞呈典型的上皮样细胞生长特性。接种后2 h开始贴壁,12 h出现聚集生长;24 h细胞体积较大,呈长梭形、星形或多边形;48 h细胞呈“铺路石”样单层排布;卵巢颗粒细胞特异标志蛋白FSHR免疫细胞化学染色阳性,表明,分离培养的是卵巢颗粒细胞;MTT法检测细胞增殖情况,牦牛卵巢颗粒细胞呈“S”形曲线生长：培养24 h内生长缓慢,处于潜伏生长期;24—48 h细胞增殖较快,进入指数生长期;48—120 h细胞平稳增殖,处于平顶期;120 h后活细胞密度开始下降,细胞进入退化衰亡期;第二代细胞生长较快,24 h进入指数增殖期,故试验选择第二代颗粒细胞进行。MTT法检测不同浓度染料木素或大豆苷元对细胞增殖的影响,结果,添加3 000 pg·mL^-1染料木素或大豆苷元作用48 h后,细胞活力均极显著增强（P<0.01）;染料木素和大豆苷元均促进颗粒细胞分泌雌二醇,大豆苷元促进效果显著（P<0.05）;染料木素显著抑制颗粒细胞分泌孕酮（P<0.05）;qRT-PCR结果显示,染料木素和大豆苷元均显著上调颗粒细胞增殖调控相关基因AKT1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax、p53和Fas的表达（P<0.01）,显著下调凋亡相关基因Bad和FasL的表达（P<0.01）,并显著上调Bcl-2/Bax比值（P<0.01）抑制细胞凋亡。此外,染料木素抑制Caspase-3表达（P<0.01）而大豆苷元促进Caspase-3表达（P<0.01）。【结论】分离培养了牦牛卵巢颗粒细胞,为牦牛雌性生殖调控机制研究提供了有效的细胞模型。试验结果表明,染料木素和大豆苷元抑制牦牛颗粒细胞分泌孕酮,促进细胞增殖,且主要通过上调Bcl-2、p53、Fas和Bcl-2/Bax,以及下调Bad和FasL的表达,保护卵巢颗粒细胞免于凋亡。     

鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

【背景】 TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】 构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号：XM_417232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示：24 h 检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。     

氨基酸副产物对白高粱青贮饲料发酵品质及体外消化率的影响

【目的】 研究适量的氨基酸副产物（amino acid by-products,ABP）对白高粱发酵品质及其消化率的影响,为减轻环境污染及新型饲料添加剂的开发与利用研究提供思路。【方法】 研究中设无任何添加剂的对照组与添加ABP、ABP+饲用菌的2个试验组进行白高粱青贮发酵试验,通过测定饲料成分和体外消化率得出ABP对青贮饲料发酵品质及消化率的影响,并通过扫描电镜（SEM）观察探讨ABP对改善饲料发酵品质及提高消化率的机制。【结果】 研究表明2.0%的ABP添加到白高粱秸秆可降低饲料pH至3.65,与对照组（5.13）差异显著（P<0.05）,感官评分属于优质青贮饲料区间。各试验组乳酸含量（ABP 组：11.95 g·kg^-1,混合组：15.14 g·kg^-1）极显著高于对照组（3.54 g·kg^-1）（P<0.01）、乙酸与丁酸含量（乙酸：ABP组：2.87 g·kg^-1、混合组：2.75 g·kg^-1,丁酸：ABP组：0.72 g·kg^-1、混合组：0.78 g·kg^-1）显著低于对照组（乙酸：3.85 g·kg^-1、丁酸：1.39 g·kg^-1）（P<0.05）,其中ABP+饲用菌的试验组乳酸含量比对照组高了327.85%;各组干物质（DM）含量变化不显著（P>0.05）,中性洗涤纤维(NDF)（ABP组：58.67%,混合组：57.67%）、酸性洗涤木质素（ADL）（ABP组：4.77%,混合组：4.27%）和灰分（Ash）（ABP 组：1.56%,混合组：2.04%）低于对照组（NDF：63.66%、ADL：5.15%、Ash：2.76%）,但差异不显著（P>0.05）,酸性洗涤纤维(ADF)（ABP组：35.77%,混合组：28.63%）极显著低于对照组（40.58%）（P<0.01）,粗蛋白含量（ABP组：9.65%,混合组：9.67%）极显著高于对照组（6.88%）（P<0.01）;各试验组体外消化率 DM（ABP组：74.66%,混合组：80.03%）、NDF（ABP 组：72.74%,混合组：83.08%）和ADF（ABP组：68.29%,混合组：79.56%）均显著高于对照组（DM：60.67%、NDF：48.06%、ADF：44.81%）（P<0.05）;结果表明ABP对青贮饲料发酵品质及消化率有明显的改善和提高作用。由SEM结果可知对照组横切面和表面结构完整、黏附的微生物数量少,而试验组表面结构蜡质层被破坏并黏附着大量的饲用菌、横切面细胞或组织内部黏附大量的饲用菌。以此初步得知ABP改善和提高青贮饲料发酵品质及消化率的机制是除饲用菌提供碳源和氮源外,饲料表面蜡质层被破坏从而促进饲用菌的黏附并降解细胞壁纤维素。【结论】 2.0%的ABP添加到白高粱青贮饲料中可显著提高发酵品质和消化率,对ABP的再利用、减轻环境污染及新型饲料添加剂的开发与利用有很大的经济和社会意义。     

宰后不同时间滩羊肉抗氧化活性的变化及可能机制

【目的】探究宰后不同时间滩羊肉抗氧化活性的变化,并从游离氨基酸、蛋白质组角度阐释其机制,为生鲜羊肉的品质保持提供数据支持。【方法】选取6只6月龄健康舍饲滩羊公羊（（18.30±1.41）kg）,在宰后0.5、3、6、12和48 h取背最长肌,测定铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）、2, 2-联氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2, 2-azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonate),ABTS）自由基清除能力、2, 2-二苯代苦味酰基苯肼（2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力、氧自由基吸收能力（oxygen-radical absorbance capacity,ORAC）、N, N-二甲基-对苯二胺（N, N-dimethyl-p-phenylendiamine,DMPD）总抗氧化能力、游离氨基酸含量和蛋白质组变化。【结果】宰后48 h内,滩羊肉中FRAP总抗氧化能力呈先下降后上升趋势,ABTS自由基清除能力呈先升高后趋于稳定趋势,DPPH、DMPD自由基清除能力和ORAC整体均呈现上升趋势;宰后48 h滩羊肉中FRAP总抗氧化能力、ABTS、DPPH、DMPD自由基清除能力和ORAC显著高于宰后0.5 h和3 h水平（P<0.05）;宰后不同时间点滩羊肉中游离氨基酸总含量差异不显著（P>0.05）,但胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的含量在不同时间点存在显著性差异（P<0.05）,且总体呈现增加的趋势。与FRAP呈显著正相关关系的游离氨基酸有7个,包括邻磷酸丝氨酸（r=0.489,P<0.01）、亮氨酸（r=0.566,P<0.01）、酪氨酸（r=0.596,P<0.01）、异亮氨酸（r=0.374,P<0.05）、苯丙氨酸（r=0.499,P<0.01）、赖氨酸（r=0.375,P<0.05）和精氨酸（r=0.376,P<0.05）;其中,亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸与FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈现显著正相关关系（P<0.05）。蛋白组学鉴定筛选出宰后不同时间滩羊肉中差异蛋白20个,与FRAP显著相关的差异蛋白有12个（P<0.05）,钙蛋白酶抑制蛋白和未知蛋白2与FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈现显著负相关关系（P<0.05）,而糖原蛋白1和蛋白激酶结构域蛋白与FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈现显著正相关关系（P<0.05）。【结论】滩羊肉抗氧化能力的升高与宰后肌肉中亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等游离氨基酸的释放有关。宰后初期肌肉中钙蛋白酶抑制蛋白、未知蛋白2等蛋白表达量的下降和糖原蛋白1、蛋白激酶结构域蛋白等蛋白表达量的上升与宰后滩羊肉抗氧化能力的变化显著相关。     

不同秸秆源NDF对巴什拜羊生产性能、器官发育和血清生化指标的影响

【目的】研究以玉米秸秆和小麦秸秆为中性洗涤纤维来源的日粮,对巴什拜羊采食量、日增重、屠宰率、器官发育及血液生化指标的变化,分析不同秸秆源的NDF对巴什拜羊生产性能和血液生化指标的影响。【方法】采用单因素试验设计,选取体重为(21.76±4.86) kg的羔羊20只,随机分为2个组,分别为Ⅰ组(饲喂玉米秸秆为纤维源的日粮)、Ⅱ组(饲喂小麦秸秆为纤维源的日粮),预试期为10 d,正试期为60 d。【结果】试验Ⅰ组、Ⅱ组羊平均日增重和干物质采食量、料重比、屠宰率差异不显著(P＞0.05),两组间试验羊头、蹄、肾脏、胃重无显著差异(P＞0.05),试验Ⅰ组肝脏和肺重量显著高于试验Ⅱ组(P＜0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ组血清球蛋白、葡萄糖、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶活性和钙磷含量均无显著差异(P＞0.05);试验Ⅰ组血清白蛋白含量、白球比、甘油三酯显著高于Ⅱ组(P＜0.05)。【结论】两种秸秆来源NDF的日粮对巴什拜羊的生长性能、屠宰性能没有显著的影响,以玉米秸秆为NDF来源的日粮对肝脏和肺部器官机体抵抗力、免疫力影响较大,以小麦秸秆为NDF来源的日粮可能更利于脂肪的消化吸收。     

昼夜节律与肉羊养分消化代谢和瘤胃发酵参数的关联

【目的】生物钟系统普遍存在于生命体的各级水平,与动物本身的消化生理及生长性能存在着密切的内在关联。试验探讨了昼夜节律与湖羊瘤胃发酵参数和养分消化代谢的关联,以期为提高育肥羊生长性能和营养物质的利用率提供依据。【方法】选用体重为(21.57±0.77) kg 健康湖羊45只,随机分为3个处理组,每组15只,各处理组采用相同的精料补充料和粗料。3个处理分别设置为：白天处理组（DH),即早上饲喂日总精料的70%+日总粗料的30%;晚上处理组(DL),即早上饲喂日总精料的30%+日总粗料的70%;对照组(CON),即早上和晚上各饲喂日总精料的50%+日总粗料的50%。饲喂两个月后,进行消化代谢试验。采用全收粪、尿法用于测定养分表观消化率和代谢率。饲养试验结束后,分别于晨饲前两小时和晚饲前2h,通过口腔采集瘤胃液样本用于相关指标测定。【结果】①试验羊只的日增重DH组为215.00g,进食量低于DL组和CON组,饲料转化比最优,为5.35,分别优于其他2组11.19 %和16.04 %。②与CON相比,DH组羊只干物质 (DM)、有机物 (OM)、粗蛋白 (CP)、中性洗涤纤维 (NDF)和酸性洗涤纤维 (ADF)消化率均高于CON 和DL组,具体：DH与DL组相比,DM消化率提高了21.42%,CP提高了22.29%,NDF提高了9.85%,ADF提高了28.69%。③氮的生物学价值DH组比CON明显提高（P>0.05）各组间可消化氮的摄入量之间无显著差异,DL组试验羊的总氮排出显著高于DH组（P<0.05）。DH组羊沉积氮、氮利用率和氮的生物学价值显著高于DL组（P<0.05）和CON组（P>0.05）。④不同处理对各组试验羊瘤胃微生物蛋白(MCP)、乙酸、和总挥发性脂肪酸(TVFA)等指标差异不显著（P>0.05）,DH组羊只瘤胃pH、乙丙比、丁酸显著低于DL组（P<0.05）。随着昼夜交替变化,瘤胃pH、NH₃-N、乙酸、丙酸、总挥发性脂肪酸和乙丙比发生显著变化（P<0.05）,相关参数值白天高于夜间。【结论】在相同日粮营养素含量条件下,改变早、晚精粗料比的分配,可提高羊只生长性能和养分的消化利用率;白昼与夜间对瘤胃发酵有影响,白天饲喂高精料日粮对瘤胃TVFA、NH₃-N和MCP含量具有促进作用。总之,早上适量提高精料比例,更符合动物机体的消化和吸收的节奏,对饲料的利用效果更佳。     

垫料床对育肥羔羊生长性能和臭气排放的影响

【目的】针对近几年肉羊育肥集中区面临臭气面源污染的难题，探讨垫料床对育肥羔羊生长性能及舍内臭气组分的影响，为育肥羊舍的臭气减排提供技术路径。【方法】选择250只体重相近、年龄一致的健康育肥羔羊，随机分为5组，根据垫料床材料不同，分为对照组（素土地面）、A组（全锯末）、B组（糠醛+锯末）、C组（稻壳+锯末）和D组（玉米芯+锯末），试验期90 d（前期1—45 d；后期46—90 d）。采用GC-MS方法，对不同试验期垫料床上部空间和垫料内部空间的臭气组分进行检测，并分析垫料床对育肥羔羊生长性能的影响。【结果】（1）4个垫料组与对照组比较，羔羊的日增重较对照组分别提高7.7 %（A组）、8.7 %（B组）、12.1 %（C组）和7.8 %（D组）（P<0.05），但日采食量和料重比未表现出显著性差异（P>0.05）；（2）整个试验期垫料床上部空间和垫料内部空间分别检测出9大类和8大类臭气组分，包括31种挥发性有机物（VOCs）（醇类4种、烷类10种、胺类3种、酚类1种、酯类7种、酮类4种、醛类2种、酸类3种和硫醇类1种）。垫料组与对照组比较，检测出的臭气组分种类基本一致。（3）从臭气组分含量分析，不同试验期不同检测空间均表现为烷类含量占比最高，达52.0 %—77.5 %，但各组间差异不显著（P>0.05），而酚类与胺类含量则表现为试验前期和后期4个垫料组2个检测空间显著低于对照组（P<0.05），其中C组降低最明显。比较前、后期的臭气含量，垫料床上部空间和内部空间均表现为前期醇类、胺类和酚类含量显著高于后期（P<0.05），但后期酯类含量显著高于前期（P<0.05）。（4）试验期间垫料床上部和内部空间检测出的主要致臭物质均为4种，即，2-乙基己醇、N,N-二甲基乙酰胺、苯酚和1H-吲哚-3-硫醇。与对照组比较，各垫料组的4种致臭成分含量均表现出降低趋势，且C组降低最明显（P<0.05）。【结论】4种组合垫料不仅改善了育肥羔羊的生长性能，还减少了空气环境中的臭气含量，为羊舍的臭气减排提供技术路径。     

干扰KISS1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响

【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E₂）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E₂的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。