肠出血性大肠埃希菌噬菌体裂解酶的毕赤酵母重组表达及裂解活性分析

为研究噬菌体V-EcoM-C1所编码裂解酶LysC1的裂解活性,在酵母菌GS115中重组表达裂解酶LysC1,并检测裂解酶LysC1对大肠埃希菌的裂解活性。结果表明:通过甲醇诱导后,含有裂解酶基因LysC1的重组表达质粒pPIC9K-LysC1能够在酵母菌GS115中表达,重组蛋白LysC1的分子量约为25ku,以外分泌方式表达,经HIS-trap HP(GE)亲和层析柱纯化后可获得有活性的重组蛋白LysC1,且该裂解酶对多种不同O抗原类型的肠出血性大肠埃希菌均具有较高的裂解活性,其最小抑菌浓度(MIC)为100μg·mL~(-1)。这一研究利用酵母表达系统成功表达出大肠埃希菌噬菌体裂解酶,且该裂解酶无需穿孔素等破膜因子的辅助,可直接裂解大肠埃希菌,为肠出血性大肠埃希菌的防控提供了新的思路和途径。     

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE与fliC基因的表达及鉴定

利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157:H7 的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在E.coli BL21(DE3)中表达.结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在E.coli BL21(DE3)中表达的rfbE、fliC具有良好的免疫活性.     

大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的原核表达

将含广东分离株大肠杆菌O157: H7 021210 eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3) pLysS, 经IPTG诱导, 进行SDS-PAGE,结果显示,目的蛋白的相对分子质量约为94 000,与 eaeA基因蛋白的理论值相符.破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在.表达蛋白经初步纯化,3次免疫新西兰兔,获得抗 eaeA蛋白的多克隆血清.经琼脂扩散试验和Western-blotting试验,表明该蛋白具有较好的免疫原性和反应原性.     

A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测

【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。     

丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157 Stx毒素表达的影响

 【目的】 确定丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157中Stx前噬菌体和Stx毒素的诱导作用。【方法】利用丝裂霉素C作诱导剂对8株溶原性大肠杆菌O157进行噬菌体诱导,以MC1061作指示菌采用双层琼脂平板法观察诱导前后的噬菌斑,并采用PCR方法对噬菌体进行鉴定。同时测定8株溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导前以及诱导8、12、16 h这4个阶段滤液中Stx毒素的表达量,毒素表达量采用WST-1细胞毒性检测试剂盒检测Vero细胞存活率。【结果】溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导后释放大量的Stx噬菌体颗粒。同时诱导后Stx毒素的表达量也显著增加,且随着诱导时间的延长毒素的表达量继续增加,但增加的幅度逐渐减缓。【结论】本研究确定了丝裂霉素C可以诱导溶原性大肠杆菌O157释放Stx噬菌体,同时也增加了Stx毒素的表达,从而增强细菌的毒力。     

丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157 Stx毒素表达的影响

 【目的】 确定丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157中Stx前噬菌体和Stx毒素的诱导作用。【方法】利用丝裂霉素C作诱导剂对8株溶原性大肠杆菌O157进行噬菌体诱导，以MC1061作指示菌采用双层琼脂平板法观察诱导前后的噬菌斑，并采用PCR方法对噬菌体进行鉴定。同时测定8株溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导前以及诱导8、12、16 h这4个阶段滤液中Stx毒素的表达量，毒素表达量采用WST-1细胞毒性检测试剂盒检测Vero细胞存活率。【结果】溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导后释放大量的Stx噬菌体颗粒。同时诱导后Stx毒素的表达量也显著增加，且随着诱导时间的延长毒素的表达量继续增加，但增加的幅度逐渐减缓。【结论】本研究确定了丝裂霉素C可以诱导溶原性大肠杆菌O157释放Stx噬菌体，同时也增加了Stx毒素的表达，从而增强细菌的毒力。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与stx1／2B融合基因的构建和表达

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157：H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗．其中亚单位疫苗具有很大优势。方法：构建表达tir和stxb的融合基因。将tir基因中间295个氨基酸残基（Tir295）与stxB亚基基因72个氨基酸串联。构建pET28a—stx2b—Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS--PAGE电沫检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果：薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％左右。结论：由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成．可刺激机体产生针时转位紧密素受体（Tir）和志贺毒素（stx）的抗体,在EHEC0157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

大肠埃希菌O157:H7致病因素的研究进展

大肠埃希菌O157:H7可使人发生腹泻、出血性结肠炎,引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症。通过对其主要致病因素包括毒力岛、粘附因子、志贺毒素Stx等研究进展进行综述,探讨大肠埃希菌O157:H7的致病机制。     

胆盐水解酶基因bsh工程菌表达条件的优化

对来源于Lactobacillus plantarum ST Ⅲ菌株的胆盐水解酶基因bsh1在工程菌E.coli BL21/pET28b bsh 1 中的表达条件进行了优化。首先通过一系列单因素实验对影响工程菌发酵条件的因素水平进行筛选。然后将诱导培养时间、诱导剂异丙基硫代 β D 半乳糖苷(isopropylthio D galactoside, IPTG) 浓度、胆盐浓度、装液量4个影响因素进行正交试验。在最佳工艺条件下得到的胆盐水解酶BSH比酶活达817.73 U。     

抗菌肽MagaininⅡ的原核表达与抗菌活性分析

根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,...     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

抗菌肽CM与haFGF改构体融合基因的构建与表达

构建重组改构体aFGF28-154和抗菌肽CM基因的融合基因,使其在大肠杆菌系统中融合表达,以期获得具有靶向FGFR高表达肿瘤细胞的抗肿瘤融合蛋白.利用PCR引物延伸的方法拼接得到带有G4S铰链的天蚕素-蜂毒素杂合肽CM与aFGF28-154的融合基因,插入大肠杆菌表达载体pET20b中,构建表达质粒pET-CM-aFGF28-154,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),氨苄青霉素抗性筛选重组转化子.IPTG诱导4 h后,菌液经超声破碎,以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的18%.将包涵体溶解并通过差速离心除去部分杂蛋白,透析复性并用Heparin Sepharose CL-6B亲和层析,目的蛋白得到初步纯化,为进一步研究蛋白的生物学活性奠定了基础.     

鲎抗菌肽polyphemusinⅡ基因的改造、克隆及其在大肠杆菌中的表达

中国鲎(Tachypleus trideutatus)血细胞产生的抗菌肽(Antibacterial peptide)—鲎素,具有广谱的杀菌、抑病毒和抗肿瘤细胞的作用。实验根据已报道的美洲鲎的抗菌肽polyphemusinⅡ氨基酸序列,设计了一对引物,并对原抗菌肽基因进行改造,在基因开放阅读框末端添加了Asn密码子,使抗菌肽羧基末端酰胺化,旨在提高其稳定性和抗菌活性。PCR扩增获得改造过的目的片段,连接于载体pMD18-T,测序后,与pEI-28c(+)连接,构建表达质粒pET28c-rr,测序鉴定正确后,转化大肠杆菌E.coli.BK21(DE3)。表达菌株经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后以包涵体的形式表达,在体外表现出明显的抑菌活性。     

拟南芥At4g12500基因原核表达载体的构建

[目的]构建拟南芥At4g12500基因的原核表达载体。[方法]以野生型Col-0拟南芥基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增出At4g12500基因编码序列,用BamHⅠ和XhoⅠ对目的片段进行双酶切后,与BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pET-28a质粒连接,以得到原核表达载体。[结果]该试验成功地构建了pET28a-At4g12500原核表达载体,并已转化至E.coil BL21(DE3)表达菌株中。[结论]为后续At4g12500基因的表达与功能分析奠定基础。