奶山羊乳腺发育过程中生长激素、胰岛素及其受体的变化规律研究

【目的】探讨奶山羊乳腺发育过程中生长激素、胰岛素及其受体表达规律。【方法】关中奶山羊乳腺发育的4个时期即青春期、妊娠期、泌乳期及退化期用放射性免疫学方法(RIA)测定激素的含量,用免疫荧光法(IF)检测激素受体含量。【结果】在乳腺发育过程中血清中生长激素(GH)变化不显著(P0.05),而组织中的GH在妊娠5月(P5M)时出现分泌高峰2.599±0.459ng·mL-1(P0.01)。血清中胰岛素(INS)在青春期含量变化差异不显著(P0.05),到妊娠1月(P1M)时INS含量高达31.664±6.416μIU·mL-1(P0.01),泌乳高峰过后回到正常水平。组织中的INS在进入妊娠期后含量开始增加并持续到泌乳10日(L10D),之后下降。生长激素受体(GHR)在妊娠期比青春期和泌乳早中期高,在泌乳晚期达到高峰,之后下降。胰岛素受体(INSR)从青春期开始缓慢上升,在泌乳启动后达到高峰。【结论】在乳腺发育过程中血清和乳腺中的GH变化不明显。血清中的INS水平在妊娠初期最高,至分娩时最低,而乳腺中INS在泌乳期处于高水平。GHR在妊娠期和泌乳后期、退化前期表达量较高。INSR在妊娠期和泌乳期维持在一个较高水平,至泌乳中后期下降。     

奶山羊乳腺中瘦素及其受体的表达与作用

 【目的】探讨瘦素在奶山羊乳腺发育、泌乳和退化各时期的表达与作用。【方法】采用激光共聚焦技术及Western Blot方法,检测瘦素及其受体（OB-Rb）的表达情况;采用乳腺组织体外培养联合免疫组化及毛细管电泳技术,测定瘦素对乳腺结构及泌乳功能的影响。【结果】乳腺整个发育过程中瘦素与瘦素受体的表达呈显著正相关,青春期最高,妊娠期下降,泌乳期维持在低水平,退化期显著升高,在退化21 d恢复到青春晚期水平。妊娠期瘦素处理组乳腺导管分支增多,泌乳期瘦素处理组乳腺组织培养基中β-酪蛋白（β-CN）含量增加;退化期瘦素处理组乳腺组织导管和腺泡结构发生部分解体,乳腺组织中可以检测到较多的凋亡细胞。【结论】瘦素能够促进妊娠期乳腺上皮细胞的增殖和分化,增加泌乳期乳腺β-酪蛋白基因表达,启动退化期乳腺细胞凋亡和乳腺组织重建。     

通草对泌乳期小鼠泌乳性能及泌乳相关内分泌激素的影响

为了从内分泌系统角度探讨通草对泌乳动物乳腺泌乳的调节机制,采用高剂量12 g(生药)/mL和低剂量4 g(生药)/mL通草提取物灌服小鼠,检测其对泌乳期小鼠泌乳量的影响,应用ELISA法检测小鼠血清和乳腺组织匀浆液催乳素(PRL)、雌二醇(E_2)、孕酮(P)和生长激素(GH)的水平,并利用Western blot技术检测乳腺组织β-酪蛋白(β-casein)、催乳素受体(PRLR)、雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、孕酮受体(PR)、生长激素受体(GHR)蛋白的表达量。结果表明,与对照组(等量生理盐水)相比,高剂量和低剂量通草提取物均显著提高了泌乳期小鼠的泌乳量(P0.05),并明显促进小鼠乳腺β-酪蛋白的表达(P0.05)。通草提取物能显著提高泌乳期小鼠血清及乳腺组织PRL、E_2、GH的水平(P0.05)。与对照组相比,高剂量组和低剂量组小鼠血清PRL、E_2、GH的水平分别显著提高112.50%、129.15%、223.48%及49.84%、68.18%、100.76%。高剂量组和低剂量组小鼠乳腺PRL、E_2、GH的水平分别显著提高60.68%、269.35%、105.19%和32.27%、129.03%、53.68%。高剂量和低剂量通草提取物能明显提高乳腺组织PRLR、ERα、ERβ、GHR的表达量(P0.05),但对血清P及乳腺组织P、PR无显著性影响(P0.05)。可见,通草能通过提高小鼠泌乳相关内分泌激素水平及上调乳腺组织PRLR、ERα、ERβ和GHR的表达,进而促进小鼠乳腺泌乳。     

芦丁对去卵巢处女大鼠乳腺发育作用的影响

 【目的】通过考察芦丁对去卵巢处女大鼠内分泌激素水平、激素受体表达的影响以及乳腺组织形态学的观察,来研究芦丁促进乳腺发育的类雌激素样作用。【方法】试验选择32只去卵巢处女Wistar大鼠,随机分为四个处理组,假手术Sham组,每日每只灌胃生理盐水(2 mL)一次;卵巢切除Ovx组,每日每只灌胃生理盐水(2 mL)一次;芦丁Ovx＋Rut组,每日每只灌服芦丁(60mg•kg-1BW)一次;雌二醇Ovx＋Est组,每周每只肌注雌二醇(60µg•kg-1BW)一次。试验为期两周,试验结束后采集大鼠血液样品、乳腺组织样品等,运用放免技术检测血浆和乳腺组织中雌激素(E2)、催乳素(PRL)、生长激素(GH)的含量,RT-PCR技术检测乳腺组织这些激素受体的表达量,并进行乳腺组织形态学观察。【结果】试验结果显示,大鼠血浆中E2的水平,Ovx＋Rut组和Ovx＋Est组高于Ovx组(P＜0.05),该两组间差异不显著(P＞0.05),Ovx＋Rut组水平低于Sham组(P＜0.05),Ovx＋Est组与Sham组差异不显著(P＞0.05),乳腺组织中E2含量呈现相同规律;PRL在血浆与乳腺组织中的含量都表现为Ovx组＜Ovx＋Rut组＜Ovx＋Est组＜Sham组(P＜0.05),血浆中GH的含量Ovx组低于Ovx＋Rut组低于Ovx＋Est组低于Sham组(P＜0.05),在乳腺组织GH含量,Ovx组低于Ovx＋Rut组和Ovx＋Est组(P＜0.05),Ovx＋Rut组低于Sham组(P＜0.05),Ovx＋Rut组和Ovx＋Est组间差异不显著(P＞0.05),Ovx＋Est组与Sham组差异不显著(P＞0.05);大鼠乳腺组织中雌激素受体ER、催乳素受体PRLR、生长激素受体GHR在Ovx组、Ovx＋Rut组、Ovx＋Est组、Sham组组间数值依次增大(P＜0.05),表现相同变化趋势;乳腺组织形态学观察发现,Ovx＋Rut组、Ovx＋Est组、Sham组乳腺组织的发育显著好与Ovx组(P＜0.05)。【结论】芦丁能够提高去卵巢处女大鼠E2水平,促进PRL、GH分泌,上调乳腺组织中ER、PRLR、GHR的表达量。     

芦丁对哺乳大鼠乳腺发育及相关激素水平与受体表达量关系的影响

研究芦丁对哺乳母鼠乳腺发育、泌乳相关激素水平及其受体表达量的影响。试验选择18只wistar哺乳母鼠,随机分为3组,分别为对照组（LacCon组）每日每只灌喂生理盐水（2ml）1次;芦丁组（Lac Rut组）每日每只灌服芦丁（60mg／kg,BW）1次;雌二醇组（LacEst组）每周每只肌注（60μg／kg,BW）1次;从哺乳第4天开始连续给药2周,基础日粮相同。检测哺乳母鼠血浆与乳腺组织中雌激素（雌二醇,E2）、孕激素（P）、催乳素（PRI,）和生长激素（GH）的含量,乳腺组织中雌激素受体（雌激素α受体,ERR）、孕激素受体（PR）、催乳素受体（PRLR）和生长激素受体（GHR）的表达量,并进行乳腺组织切片组织形态学观察。试验显示：E2、PRL和GH在血浆与乳腺组织里的含量都表现为Lac—Est组〉Lac～Rut组〉LacCon组（P〈0．05）;P含量组间差异不显著（P〉0．05）;ER、PR、PRLR和GHR在乳腺组织中的表达量均为Lac—Est组〉LaCRut组〉Lac—Con组（P〈0．05）;乳腺腺泡／管腔直径统计显示Lac-Est组和LacRut组高于LacCon组（P〈0．05）,LacEst组与LacRut组差异不显著（P〉0．05）。试验结果表明,芦丁能够提高哺乳母鼠体内E2水平,促进PRL和GH分泌,诱导ER、PR、PRLR和GHR的表达,具有弱雌激素样作用功效。     

热应激状态下泌乳奶牛通过激活GHIGF-I轴增强糖异生变化

【目的】选取分娩1周后的泌乳期荷斯坦奶牛6头,提前适应期1周后,正式饲喂从2013年6月29日至8月5日,总共35 d(5周),使泌乳奶牛处于热应激状态。进而检测泌乳奶牛乳产量及乳蛋白含量,血液中生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、葡萄糖以及肝脏中热休克蛋白70(HSP70)和糖异生作用的变化情况,拟从GH-IGF-I轴的角度阐明泌乳奶牛发生热应激时对糖异生作用及乳品质下降的机制。为进一步揭示奶牛热应激的发生机理及控制奶牛热应激的发生提供理论依据。【方法】分别统计第1—5周泌乳奶牛的产奶量及分析乳蛋白含量,并采集泌乳奶牛颈静脉血液和进行活体采取肝脏组织的方法,检测血液中葡萄糖和GH、IGF-I的含量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对奶牛肝脏组织中HSP70和糖异生的关键酶丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)进行检测。【结果】在35 d的饲喂过程中,日间平均气温在32℃以上的持续时间达25 d,且最高温度为38℃,高温持续时间大于72 h,即此气候条件下奶牛处于一个热应激状态。随着泌乳奶牛热应激程度的不断加深,从第1周到第5周产奶量和乳蛋白含量都有不同程度的下降。通过比较第5周和第1周泌乳奶牛肝脏中HSP70的表达,发现第5周HSP70的表达量极显著高于第1周。检测血液中GH、IGF-I以及葡萄糖的含量,发现在第5周的时候其含量均高于第1周且差异显著(P0.05);检测泌乳奶牛肝脏组织中PC和PEPCK的表达水平,发现第5周显著高于第1周(P0.05);通过检测第5周与第1周肝脏组织中GH和IGF-I受体的表达水平,发现GHR和IGFR同样上调,其中IGFR显著上调(P0.05)。【结论】随着泌乳奶牛热应激的程度的不断加深,血液中的葡萄糖含量显著升高,其可能是由于垂体分泌的GH刺激肝脏产生更多的IGF-I,即通过GHIGF-I轴上调肝脏糖异生途径关键酶的表达,使糖异生途径处于激活状态。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前体物被过多的用来进行糖异生作用,增加血液中葡萄糖含量,维持机体正常供能所致。     

生长激素受体激活剂的制备及鉴定

【目的】制备生长激素受体的单克隆抗体,探讨其对生长激素受体的激活作用,为研究生长激素模拟物提供新思路。【方法】以生长激素受体胞外域(GHBP)免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤技术制备抗生长激素受体的单克隆抗体,用流式技术筛选抗体,通过流式、激光共聚焦显微镜观察研究该单克隆抗体对生长激素受体的激活作用,然后通过Western-blot等技术手段研究其胞内的信号通路。【结果】通过杂交瘤技术共获得了30个分泌抗生长激素受体的单克隆抗体,经流式分析筛选到具有受体激动剂活性的单克隆抗体(命名为L8)。竞争性结合分析结果表明,L8在受体上的结合表位与生长激素重叠;激光共聚焦观察结果表明,L8不但能结合到细胞表面的生长激素受体,而且还能内化进入胞体。经Western-blot和流式分析表明,L8能与转染GHR基因的CHO-GHR638细胞表面的生长激素受体结合,并启动JAK2-STAT5、ERK1/2信号转导通路,且呈现出剂量依赖性。【结论】生长激素受体抗体可以作为受体的激动剂,其可能是通过诱导受体构象变化的方式激活受体,并启动JAK2-STAT5等信号转导通路。     

禽类生长激素受体基因研究进展

生长激素受体(GHR)是促乳素、生长激素、细胞因子、促红细胞生成素受体超家族成员之一,它与生长激素(GH)结合可对禽类生长发育起到调节作用.目前有关禽类GHR的研究多集中在正常鸡和矮小禽类之间GHR的变异上.本文就鸡GHR基因结构与表达、多态性与生产性能的相关等研究进行了综述和讨论.     

卵巢摘除对山羊血清GH水平和组织中GHR基因表达的影响

【目的】探讨卵巢摘除对母山羊产肉性能,血清中生长激素（growth hormone, GH）水平以及背最长肌、股二头肌、肝脏、脂肪组织中生长激素受体基因(growth hormone receptor, GHR) 表达的影响,揭示摘除母山羊卵巢提高其育肥效果的原因。【方法】将体重相近的5月龄布尔山羊杂种（布尔山羊♂×关中奶山羊♀）母羊40只作为研究对象。试验开始前一个月,对所有羊只进行驱虫和防疫工作。试验开始时将母羊随机分为处理组和对照组,每组20只,摘除处理组母羊的卵巢,对照组不摘除。在试验的第0,10,20,30,40 和50 天早晨8：00对所有试验羊进行空腹采血,立即分离血清,采用羊生长激素酶联免疫分析试剂盒测定血清中GH水平。50 d后分别从处理组和对照组随机选取5只试验羊进行屠宰试验,测定其屠宰率、胴体产肉率、眼肌面积和骨肉比。同时,立即采取肝脏、背最长肌、股二头肌及肾周脂肪组织样,每个组织至少采集3份生物学重复样,用锡箔纸包好标记后立即投入液氮中,带回实验室放入-80℃冰箱保存,然后利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）相对定量技术和2-△△Ct法检测背最长肌、股二头肌、肝脏和肾周脂肪中GHR基因mRNA的相对表达量。【结果】对照组母羊血清GH浓度在试验的第20天为8.63 μg•L-1,处理组母羊达到9.50 μg•L-1,显著高于对照组(P＜0.05),且随着试验进行呈上升趋势。处理组母羊血清GH浓度在第50 天时达到了11.55 μg•L-1,高出对照组（9.34 μg•L-1）2.21 μg•L-1,且两组间差异极显著（P＜0.01）。另外,发现处理组母羊的屠宰率、胴体产肉率和眼肌面积均高于对照组,且处理组母羊屠宰率达到了45.62% 显著高于对照组的42.41%（P＜0.05）,但是骨肉比则显著低于对照组（P＜0.05）。实时荧光定量PCR的结果显示处理组母羊肝脏中GHR基因mRNA的表达量是对照组的3.21倍（P＜0.01）;GHR基因在处理组母羊背最长肌中的相对表达水平最高,是对照组的4.87倍,且两组间差异极显著（P＜0.01）;股二头肌中GHR基因表达量是对照组的3.17倍,差异极显著（P＜0.01）;在肾周脂肪中,处理组母羊GHR基因的相对表达量是对照组的1.91倍,显著高于对照组（P＜0.05）。【结论】摘除母山羊卵巢后,其屠宰率、血清GH水平以及肝脏、背最长肌、股二头肌和肾周脂肪GHR基因表达均显著上升,骨肉比显著下降。这提示摘除母畜卵巢可能通过增加其血清GH水平和部分靶组织中GHR基因的表达提高母羊的屠宰率,降低骨肉比,从而有利于母羊的产肉性能的提高。     

鸭发育早期下丘脑-垂体生长轴相关基因mRNA的表达特异性分析

【目的】选择生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验模型,3种不同品种鸭胚胎期和出雏早期下丘脑垂体生长轴相关基因的表达规律及其与体重和肝重的相关性。【方法】采用实时荧光定量PCR方法研究鸭13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄下丘脑生长激素释放激素（growth hormone release hormone,GHRH）与生长抑素（somatostatin,SS）、垂体生长激素（growth hormone,GH）和肝脏生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）与胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors,IGFs） mRNA的表达规律。【结果】证实鸭下丘脑GHRH与SS、垂体GH和肝脏GHR与IGF-I在13胚龄已有表达;除了SS在鸭发育早期维持一个低表达状态外,其它的4种基因均呈现极显著的品种和时间特异性;除了GH外,发现鸭早期发育过程中GHRH、GHR和IGF-I mRNA的表达受到品种和日龄的交互作用的极显著影响。与鸡以往的研究相比,禽类胚胎期下丘脑垂体生长轴相关基因mRNA的表达存在着种属差异。本试验发现鸭早期发育过程中,体重和肝重的变化也呈现极显著的品种和时间特异性,且与下丘脑垂体相关基因的表达呈现不同程度的线性相关。【结论】结果提示下丘脑垂体生长轴基因 mRNA的表达可能在鸭早期发育过程中发挥着重要作用,遗传背景的差异可以导致鸭发育早期体重的差异生长和相关基因的差异表达。     

大鼠不同时期乳腺组织及血液中雌激素变化规律

研究大鼠不同时期乳腺及血液中雌激素变化规律。选择雌性SD大鼠42只,分别为处女期、妊娠前、中、后期,每期间隔6d,泌乳期前、中、后期,每期间隔6d,每期6只。规定时间取各期大鼠乳腺组织及血清。通过放免测各个时期雌激素含量并进行分析。结果表明大鼠血清E2水平中处女期最高,妊娠开始呈现先降后升趋势,而泌乳各时期呈逐渐下降趋势。处女期与其它时期差异显著(P<0.05),整个妊娠期以妊娠后期最高,且差异不显著(P>0.05);泌乳前、中、后期明显高于妊娠期水平(P<0.05);乳腺E2:泌乳前期最高,然后呈现下降趋势,处女期与各期差异显著(P<0.05),泌乳前期明显高于其它时期(P<0.05),而显著高于妊娠中期和后期(P<0.05)。雌激素在维持乳腺发育及启动和维持泌乳方面发挥着重要作用。     

不同发育期大鼠乳腺组织中孕酮受体的表达研究

为了探讨大鼠乳腺中孕酮受体(PR)的变化规律,试验采用RT-PCR方法对不同发育时期大鼠乳腺组织中的孕酮受体表达进行了半定量研究。结果表明,妊娠18 d的PR表达水平明显低于处女期和妊娠6,12 d (P<0．05),整个妊娠过程中,以妊娠12 d最高;在泌乳6 d时检测不到PR,泌乳12,18 d可检测到PR表达,泌乳 18 d的PR水平低于泌乳12 d,但差异不显著(P>0．05)。表明PR可能参与了乳腺细胞的发育和泌乳。     

大鼠不同时期乳腺组织及血清中孕激素变化规律

探讨大鼠不同时期乳腺组织及血液中孕激素（P）变化规律。选择雌性SD大鼠42只,分为7个时期,每个时期6只：分别为处女期,妊娠第6天、12天、18天,泌乳第6天、12天、18天。分别处死大鼠取乳腺组织及血清,通过放射免疫检测不同时期孕激素含量。结果表明血清中：处女期P含量最低,妊娠后呈现上升趋势,其中妊娠18d与各个时期差异显著（P〈0．05）;泌乳后又呈现下降趋势。7个时期中处女期与其它6个时期差异显著（P〈0．05）;乳腺组织：7个时期整体呈下降趋势,并且处女期与妊娠、泌乳整个时期差异显著（P〈0．05）。结果显示：孕激素在乳腺细胞发育、启动和维持泌乳方面发挥重要作用。     

Hormonal stimulation of lactose synthetase in mammary carcinoma

A transplantable rat mammary carcinoma (R3230AC) synthesizes significant quantities of the mammary gland enzyme lactose synthetase in the immature virgin female rat. In this hormonal environment, mammary glands do not synthesize the enzyme. Prolactin further stimulates the enzyme activity in the tumors to levels found only in mammary glands of rats in late pregnancy or during lactation.     

小鼠乳腺发育、泌乳和退化的组织形态学(Ⅰ)——一般组织形态学变化

文章研究小鼠乳腺发育、泌乳和退化的一般组织形态学变化,为产奶动物泌乳生物学与乳腺功能调控奠定实验基础。将小鼠青春期、妊娠期、泌乳期和退化期乳腺,制成石蜡切片用HE染色方法在普通光镜下进行组织结构观察。结果发现,在性成熟前或两个泌乳期之间的乳腺静止期,乳腺内主要是结缔组织、分散的输出导管和一些萎缩、塌陷的腺泡或实心的细胞索,腺泡及小导管均为单层立方上皮;性成熟后,乳腺分泌部和导管都开始发育,特别是妊娠期乳腺组织发育尤为迅速,结缔组织包绕在腺泡周围和小叶间;分娩后进入泌乳期,乳腺处于全面活跃状态,泌乳后期乳腺停止泌乳活动,结缔组织和脂肪组织增殖;退化期或老龄后乳腺腺组织及导管退化,被结缔组织和脂肪取代;小鼠青春期、妊娠期、泌乳期和退化期乳腺组织结构呈现有规律的周期性变化。     

小鼠乳腺发育、泌乳和退化的组织形态学(Ⅱ)——超微组织形态学变化和β-酪蛋白分泌

研究小鼠乳腺发育、泌乳和退化的超微组织形态学以及蛋白质分泌功能变化,为产奶动物泌乳生物学与乳腺功能调控奠定实验基础;将小鼠青春期、妊娠期、泌乳期和退化期乳腺,一部分制成超薄切片复染法染色后在透射电镜下进行超微结构观察,另一部分制成冰冻切片应用免疫组织化学染色方法进行β-酪蛋白分泌跟踪。结果为透射电镜观察见青春期(性成熟前期和退化期)或静止阶段乳腺上皮细胞胞质内含细胞器相对较少,泌乳期上皮细胞变成高柱状或立方形,胞质内内质网丰富,近腺腔处见大量分泌颗粒,泌乳期乳腺肌上皮细胞内可见少量分泌小泡;β-酪蛋白跟踪染色发现,β-酪蛋白在妊娠初期就有表迭,到泌乳期达到相对稳定水平;小鼠青春期、妊娠期、泌乳期和退化期乳腺结构呈现有规律的周期性变化。     

生长抑素对泌乳大鼠乳腺发育的作用

给泌乳SD大鼠皮下注射生长抑素及其耗竭剂,用RT-PCR法和放射免疫法检测大鼠乳腺中相关基因的表达水平及乳腺和血清生长抑素的水平,探讨生长抑素与相关因子间的关系。结果表明：生长抑素能提高大鼠血清和乳腺生长抑素的含量,下调ERα、PR、GHR、PRLR基因的表达,上调Leptin和LEPR基因的表达;其耗竭剂的作用相反,降低血清和乳腺中生长抑素的含量,上调ERα、PR、GHR、PRLR基因的表达,下调Leptin和LEPR基因的表达。说明生长抑素通过调节乳腺中相关因子的表达对大鼠乳腺发育起作用。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。