氯氰菊酯与DNA相互作用的光谱研究

[目的]对农药氯氰菊酯与DNA的相互作用进行研究,揭示其致畸的作用机制。[方法]在pH值7．4的‘蹦s．HCI缓冲溶液体系中,利用紫外吸收光谱法和荧光探针,对氯氰菊酯与DNA的结合方式和结合常数进行研究。[结果]氯氰菊酯在256nm处的紫外吸收峰随着DNA的加入发生了显著蓝移,同时吸光强度逐渐增大,DNA在203ntn处的紫外吸收峰随着氯氰菊酯的加入发生了显著红移,同时吸光强度逐渐降低,这说明氯氰菊酯与DNA形成了复合物;固定DNA浓度（3．4×10^-4moll／L）,改变氯氰菊酯浓度（1×10^-5 6×10^-5mol／L）,在203nm处测定吸光度,计算得到37℃时结合常数K为7．19×10^3L／mol;结合荧光探针试验证明氯氰菊酯与DNA是以沟槽方式结合。l结论I氯氰菊酯与DNA以沟槽方式结合可能是氯氰菊酯具有致畸作用的原因．     

异丙威及其水解产物对DNA潜在损伤作用的研究

根据异丙威和DNA作用后形成加合物的过程可以从其吸收光谱和荧光光谱的变化反映出来,异丙威水解产物和DNA作用后会导致电化学峰正移以及电流减小的原理,用荧光光谱法、紫外吸收光谱法及电化学方法研究了异丙威及其水解产物与DNA的相互作用。结果表明,无论是异丙威还是其水解产物,都能与DNA发生嵌插作用并对其造成损伤。通过计算两者和DNA作用的结合常数,发现异丙威的水解产物与DNA的结合常数更大,即更易和DNA形成加合物而损伤DNA。     

一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析

【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(Deferribacter desulfuricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-DePif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5′26nt tail和dsDNA with 5′26nt tail)的解旋活性。【结果】每升菌液可获得9 mg纯度大于95%的DePif1解旋酶。DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA单链DNA双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA。【结论】成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力。     

脂质体LTX介导高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)条件的优化

探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24h的转染效率。结果显示：在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5：1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2％。     

基于脱氧核酶-等温级联放大耦合的传感体系高灵敏检测水样中铅离子

我们结合等温直链替代反应（SDA）和指数扩增（EXPAR）设计了一种非标记、高灵敏的Pb2+荧光生物传感体系。在 Pb2+存在情况下，底物链被活化的GR-5 DNAzyme快速切割释放引物1。引物1与模板1杂交，并被DNA聚合酶（BSM）延伸形成带限制性内切酶（Nt.BbvCI）的识别序列的双链核苷酸。BSM从Nt.BbvCI切割产生的切口再次延伸形成双链核苷酸，并释放信号G4-DNA片段。G4-DNA片段同时又可以作为模板2的引物，启动指数放大过程，从而释放更多的信号G4-DNA片段。最后，扩增产物G4-DNA与原卟啉锌(ZnPPIX)相互结合从而产生强烈的荧光信号。我们详细优化了多种因素对检测体系的影响，在最优实验条件下，此方法对Pb2+的线性检测范围为 0.1~50 nM，检出限为0.03 nM（S/N=3），回归方程为 y=288.7x+744.7(y为荧光强度，x为Pb2+浓度)。干扰实验表明，该传感器对Pb2+具有良好的特异性和选择性。该传感体系成功应用于环境水体中 Pb2+含量检测，加标回收率为 94.0%～103.0%。本方法操作简单、选择性好、灵敏度高、有较强的抗干扰性能，可用于环境水样中Pb2+的高灵敏检测。     

p53-EGFP表达载体的构建及其对A549的影响

构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体,并验证其对肺癌细胞A549的影响。以质粒pcDNA3.1-p53为模板,设计引物并进行PCR扩增获得目的基因p53,将获得的目的基因克隆至载体pcDNA3.1-EGFP上,用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,双酶切以及测序验证。将克隆好的载体,利用脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜下观察,同时用MTT法测不同时间段细胞OD值。结果表明,琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因扩增成功。双酶切及DNA测序结果均证实,成功构建了载体pcDNA3.1-EGFP-p53。转染A549细胞后,荧光显微镜下观察到绿色荧光。MTT法测定结果表明,目的基因转染的A549细胞组所测得的OD值明显低于对照组(p0.01)。因此,具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体pcDNA3.1-EGFP-p53构建成功,转染A549细胞后,对A549细胞具有一定抑制作用。为后续继续研究p53-MDM2生物发光能量共振转移作用奠定了基础。     

染色质免疫沉淀技术（ChIP）在基因转录调控中的作用

目的研究体细胞水平蛋白（转录因子）与DNA（靶基因启动子区）的相互作用.方法用甲醛固定活细胞,在生理状态下,结合的蛋白质-DNA复合物呈交联状态,超声将DNA打断成不同大小的片段,用目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物,复合物65℃解交联,并分离纯化DNA,然后进行PCR扩增.结果PCR扩增出阳性条带.结论ChIP是一项在不同生理条件下探测转录因子与DNA结合的成熟技术.     

β淀粉样肽25-35对PC细胞p53和bcl-2基因表达的影响

目的：观察β淀粉样肽25-35（β-amyloidpeptide25-35,Aβ25-35)诱导PC12细胞凋亡和对p53及bcl-2基因表达的影响。方法：采用终浓度分别为0、5、10、20μmol／L Aβ25-35处理PC12细胞24h,用MTT比色法分析细胞存活率,Hoechst33258-PI荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变,DNA电泳观察梯状条带(DNA-Ladder),RT-PCR和Western blot检测p53和bcl-基因表达变化。结果：随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低,凋亡明显增加,p53基因表达增加,bcl-2基因表达降低。结论：Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡可能与上调p53基因,下调bcl-2基因有关。     

果蝇p53基因的克隆及序列分析

从紫外刺激的果蝇(Drosophila melanogaster)抽提总RNA,通过RT-PCR方法扩增得到有完整读码框的p53基因,并且通过对p53基因的序列分析表明,所得到的序列与网上已经登陆的果蝇p53序列有99.4%的相似系数,而与其他生物的p53序列存在一定的分歧。系统进化树的分析表明,7个物种来源的p53基因起源于同一个祖先分子,且同属于一个有相似功能作用的蛋白家族。但由于长久以来的进化发展,p53基因在不同的物种内发生了一定的突变,并延续了这种变异。     

杀鼠剂溴敌隆与小牛胸腺DNA的相互作用

利用紫外光谱和荧光光谱研究二代抗凝杀鼠剂溴敌隆(BRD)与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用.结果表明:ct-DNA可使BRD的紫外吸收光谱发生增色,但试验中没有观察到明显的光谱红移及等吸收点的出现;ct-DNA对BRD的稳态荧光有明显的猝灭作用,属于静态猝灭方式;通过热力学分析判断BRD与ct-DNA之间的相互作用主要是氢键和范德华力作用.吸收光谱、竞争试验、阴离子猝灭试验以及离子强度影响试验一致表明,BRD与ct-DNA之间主要以沟区结合方式发生作用.     

阿司匹林与DNA相互作用的光谱研究

[目的]研究阿司匹林（ASP）与DNA相互作用的机理。[方法]在pH值为4．5的Tnis—HCl缓冲溶液体系中,应用荧光光谱法和紫外光谱技术研究ASP和DNA分子间的相互作用;利用Stem-Volmer方程探讨DNA对阿司匹林的荧光猝灭机制。[结果]DNA与ASP之间存在较强的相互作用,25qc时结合常数为2．17×10^6L／mol,结合位点数为1．7735,结合方式是ASP通过嵌入结合的方式与DNA结合。[结论]该研究可为进一步研究ASP的药理活性提供重要信息。     

4,4'-二硝基-2,2'-联咪唑及其铜配合物的合成·表征及与DNA相互作用研究

[目的]研究4-硝基咪唑衍生物及其配合物与DNA的相互作用,为药物的定向合成提供理论基础。[方法]合成4,4'-二硝基-2,2'-联咪唑及其铜配合物,对其性质进行表征,并以紫外光谱、荧光光谱及黏度法初步研究配体及其配合物与小牛胸腺DNA之间的相互作用。[结果]元素分析、IR、UV及摩尔电导率等数据表明4,4'-二硝基-2,2'-联咪唑与铜发生了配位;配体及配合物与DNA作用后其紫外光谱和荧光光谱都发生了一定变化,两者对DNA黏度也有不同的影响。[结论]配合物的可能组成为Cu[(NO2)2biim]2SO4.2H2O,配体及其配合物与小牛胸腺DNA之间的相互作用方式分别为非经典插入式和部分插入式。     

两种杀虫剂对甘蓝蚜的毒力测定及室内药效试验

 在室内用氯氰菊酯、敌敌畏分别对甘蓝蚜［Brevicoryne brassicae(Linnaeus)］进行了毒力测定及防治试验。结果表明:氯氰菊酯和敌敌畏乳油对甘蓝蚜的ＬC₅₀分别为4.113 7,116.486 1 μg/mL,10%氯氰菊酯和80%敌敌畏乳油分别稀释成1 500～3 000倍液和1 500倍液对甘蓝蚜的室内防治效果较好,其药后第1～5 d的防效分别为75.3%～87.4%和76.7%～86.6%.     

白黎芦醇与DNA相互作用研究

[目的]为进一步研究白黎芦醇药理活性提供信息基础。[方法]在pH值为6的Tris缓冲溶液体系中,应用荧光光谱法和紫外光谱技术以及黏度法研究白黎芦醇和DNA分子间的相互作用,计算白黎芦醇与DNA的结合常数和结合位点数。[结果]25℃时,白黎芦醇与DNA之间的结合常数为3．96×10^3L／mol,结合位点数为1．0053,结合方式是白黎芦醇通过嵌入结合的方式与DNA结合,这种结合方式可能是白黎芦醇具有抗癌功效的一个重要因素,即白黎芦醇通过嵌入方式与DNA结合,影响DNA的转录和复制,从而导致癌细胞凋亡。[结论]证明白黎芦醇是以嵌入结合的方式与DNA结合,这种结合方式可能是白黎芦醇具有抗癌活性的一个重要原因。     

草鱼体内氯氰菊酯残留GC-ECD测定

运用GC-ECD法测定草鱼肌肉组织中氯氰菊酯农药的残留量。采用内标法,对草鱼体内农药残留采用石油醚提取,提取溶液干净,通过弗罗里硅土层析柱净化,GC-ECD测定。结果表明：草鱼肌肉组织中氯氰菊酯的添加回收率为98.32%-101.57%;RSD为2.3～3.1;最小检出限为0.001mg/kg。此方法具有选择性强,操作简单,分离效果好,回收率和灵敏度高等特点。     

氯氰菊酯在苹果及土壤中的残留动态研究

用带电子捕获检测器的 GC-9A 气相色谱仪测定了氯氰菊酯(cype-rmethrin)在苹果和土壤中的残留量和消解动态。两年的试验结果表明,氯氰菊酯在苹果和土壤中的消解速度是相当慢的。氯氰菊酯在苹果和土壤中的半衰期分别为9天和12天。在整个水果生长期,使用氯氰菊酯25ppm 和50ppm 喷施2-4次,最后一次施药距采收间隔期为56-25天,氯氰菊酯在苹果中的残留量分别为0.0335-0.0968ppm 和0.1058-0.2300Ppm,而土壤中氯氰菊酯的残留量低于最小检出浓度。施药浓度为100ppm 使用2-4次时,最后一次施药距采收间隔为25天,氯菊氰酯在苹果和土壤中的残留量分别为0.2967ppm 和0.233ppmm。     

氯氰菊酯降解菌Y-3的诱变育种与筛选

以从菠菜叶片内分离到对氯氰菊酯降解率较高的菌株Y-3(Corynebacterium vitarumen)为出发菌,进行化学诱变和紫外诱变.结果显示,DES对菌株Y-3的最佳诱变条件为2%60 min、3%40 min和4%20 min,紫外线对对菌株Y-3的最佳诱变条件为5 cm 8 min、10 cm 20 min和15 cm 30 min.通过诱变与筛选,最终获得13株突变株,与野生菌株对比,7株突变株对氯氰菊酯的降解率有明显的提高,其中有3株突变株具有一定的遗传稳定性.