| 一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析 |
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| 引用本文： | 赵正阳,刘娜女,李海红,等.一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析[J].西北农林科技大学学报(社会科学版),2016,44(1):169-176. |
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| 作者姓名： | 赵正阳 刘娜女 李海红 等 |
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| 作者单位： | 西北农林科技大学 生命科学学院,西北农林科技大学 生命科学学院,西北农林科技大学 生命科学学院 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目（31370798，11304252） |
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| 摘 要： | 【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(Deferribacter desulfuricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-DePif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5′26nt tail和dsDNA with 5′26nt tail)的解旋活性。【结果】每升菌液可获得9 mg纯度大于95%的DePif1解旋酶。DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA单链DNA双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA。【结论】成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力。
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| 关 键 词： | 嗜热脱铁去硫弧菌 Pif1解旋酶 G4-DNA 表达纯化 解旋活性 |
| 收稿时间： | 2014/4/25 0:00:00 |
Expression,purification and activity analysis of Pif1 helicase from thermophile Deferribacter desulfuricans |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Deferribacter desulfuricans Pif1 helicase G4-DNA expression and purification activity analysis |
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