免疫抑制素/卵泡抑素对家畜胚胎体外生产效率的提高

在家畜卵母细胞体外成熟培养过程中添加不同浓度的抗抑制素抗体或抗卵泡抑素抗体,通过观察卵母细胞的成熟率、激活后的卵裂率及囊胚发育率,研究免疫抑制素与卵泡抑素对家畜卵母细胞体外发育能力的影响。结果显示:就水牛、奶牛及猪而言,在卵母细胞成熟过程中分别单独添加抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体均能显著提高卵母细胞的体外成熟与卵裂率,添加的适宜浓度为50~100μg/ml。而添加抗卵泡抑素抗体还能显著提高水牛和猪的囊胚发育率。卵母细胞体外成熟期添加抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体能显著提高卵母细胞的发育能力,提高早期胚胎的发育数量和质量,为改善家畜胚胎体外发育和生产提供了新方法。     

db-cAMP和卵丘细胞单层对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育潜力研究

为提高卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的能力,探讨了双丁酰基腺苷酸环化酶(db-c AMP)和卵丘细胞单层共培养对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育潜力。结果表明,成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-c AMP时,卵母细胞的体外成熟率依次降低,但浓度为1 mmol/L时的孤雌胚囊胚率(27.03%)显著高于其他各组(P0.05);卵丘细胞单层共培养卵母细胞时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显著提高;0.4 mmol/L的db-c AMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显著,但囊胚率(35.14%)显著提高。0.4 mmol/L的db-c AMP和卵丘细胞单层共培养能够显著提高猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的发育潜力。     

不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

[目的]系统比较了在成熟培养液中添加Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚的发育率和囊胚质量,同时比较了成熟培养液和胚胎培养液添加Leptin对孤雌激活胚发育的影响。[方法]成熟培养液中添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目,并且研究了成熟培养液和胚胎培养液单独或联合添加Leptin对猪早期孤雌胚胎发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目。[结果]成熟培养液中添加不同浓度Leptin(0,10,50,100和200 ng/ml),体外成熟44 h,卵母细胞核成熟率统计分析差异不显著(P>0.05);将核成熟卵母细胞进行化学激活,第2天胚胎卵裂率统计分析差异不显著(P>0.05),但100ng/ml组与其他组第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数差异显著(P<0.05);成熟液添加Leptin 100 ng/ml、胚胎培养液添加Leptin 10 ng/ml与其他组第7天的囊胚率及囊胚的内细胞团细胞数差异显著(P<0.05)。[结论]Leptin对卵母细胞成熟和孤雌胚胎发育能力上有相辅相成的作用。     

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。     

猪冷冻精子的体外受精与单精子胞浆内注射

用猪冷冻精子进行体外受精和单精子胞浆内注射(ICSI),并研究添加L-半胱氨酸及不同成熟培养法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明:用猪冷冻精子生产的ICSI胚胎卵裂率及囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冷冻精子进行体外受精(IVF)所获得的卵裂率和囊胚发育率(分别为76.9%和19.2%,P<0.05)。在培养液中添加1.71mmol·L~(-1) L-半胱氨酸培养3 h,无论是卵裂率、桑椹胚发育率,还是囊胚发育率,均未得到明显改善(P>0.05);采用含0.4%BSA的NCSU-23培养液进行猪卵母细胞成熟培养,ICSI胚胎卵裂率虽明显高,但各组所获胚胎发育率均无显著差异(P>0.05),表明所用卵母细胞的成熟方法并未对ICSI胚胎发育产生明显的影响;用颗粒细胞或卵丘细胞共培养ICSI胚胎后,卵裂率有明显提高(P<0.05),但各组囊胚发育率无统计学差异。     

胰岛素和半胱氨酸对猪孤雌胚早期体外发育的影响

探讨在NCSU-23中添加不同浓度的胰岛素和/或半胱氨酸对猪孤雌胚体外发育的影响.结果表明,在试验1中,添加胰岛素的质量浓度为2.5 μg/mL时,猪孤雌胚的卵裂率及囊胚率显著高于对照组(P<0.05);在试验2中,添加半胱氨酸的浓度为1.2 mmol/L时,猪孤雌胚囊胚发育率最高,但添加的浓度大于4.8 mmol/L时,猪孤雌胚的囊胚发育率显著降低(P<0.05);在试验3中,联合添加胰岛素和半胱氨酸时能显著提高猪孤雌胚的囊胚率(P<0.05).因此,在NCSU-23中添加一定浓度的胰岛素和/或半胱氨酸能提高猪孤雌胚发育到囊胚阶段的能力.     

HMG、EGF和TGF-α对猪卵母细胞体外成熟及发育的影响

以TCM199为基础培养基,HMG(尿促性素)为激素,探讨了HMG在猪卵母细胞体外成熟(IVM)和发育中的影响;同时对EGF(表皮生长因子)和TGF-α(转化生长因子-α)单独或联合使用对猪卵母细胞IVM及发育的影响进行了研究,以确立猪卵母细胞IVM较好的培养体系。结果表明:①在猪卵母细胞IVM中分别添加0.075、0.15、0.2、0.3 IU/mL的HMG,其中添加0.2 IU/mL的HMG组卵母细胞的成熟率和激活后的卵裂率显著高于其它组,差异显著(P<0.05);②添加50 ng/mL的EGF组成熟率和卵裂率高于对照组和添加30、40、60 ng/mL组,差异显著(P<0.05);③添加15 ng/mL的TGF-α组成熟率高于对照组和添加5、40ng/mL组,有显著差异(P<0.05),激活后卵裂率添加15 ng/mL组显著高于其他组(P<0.05),当TGF-α的浓度高于15 ng/mL后对卵母细胞的成熟和激活后的卵裂没有显著的提高作用;④同时添加EGF和TGF-α组成熟率和卵裂率与对照组相比差异显著(P<0.05),但与添加50 ng/mL EGF、15 ng/mLTGF-α组相比没有明显不同(P>O.05)。可见EGF和TGF-α对猪卵母细胞的IVM和激活后的卵裂没有明显的协同作用。     

ITS、卵巢保存温度及所处性周期对黄牛卵母细胞和孤雌胚体外发育的影响

研究了ITS、卵巢保存温度及所处性周期阶段对黄牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚体外发育的影响.结果表明,在成熟液中添加10μL·mL-1,的ITS对黄牛卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大,但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67%/32.00%);牛卵巢从采集到送达实验室保存在30～39%的灭菌生理盐水中可以获得较高的成熟率和囊胚发育率(71.34%/41.84%);黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率,但差异不显著(P>0.05).     

成熟液中不同来源促性腺激素对猪卵母细胞早期孤雌发育的影响

为探讨不同来源的促性腺激素对猪卵母细胞早期孤雌发育的影响,将猪卵母细胞置于添加有不同来源促性腺激素(分别来自美国Sigma公司和中国科学院动物研究所)的成熟液中体外成熟40～44 h,成熟卵母细胞经化学孤雌激活后放入胚胎培养液中继续培养,分别于第48小时和第168小时统计卵裂率和囊胚发育率。结果发现,成熟液中同时添加0.5μg/mL中国科学院动物研究所生产的促性腺激素(FSH和LH)的卵裂率和囊胚发育率均略高于其他处理组,分别达到(65.68±24.13)%和(28.41±18.74)%;在囊胚细胞数方面,无论是添加中国科学院动物研究所还是Sigma公司生产的促性腺激素,均以添加浓度为0.5μg/mL时的囊胚细胞数最高。结果表明,两种来源促性腺激素对猪卵母细胞孤雌激活后早期发育的影响无显著差异,说明中国科学院动物研究所生产的促性腺激素(FSH和LH)能有效促进猪卵母细胞体外成熟和进一步孤雌发育效果,且以在成熟液中同时添加0.5μg/mL FSH和0.5μg/mL LH为宜。     

颗粒细胞和培养微滴大小对牛卵母细胞体外受精后胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为材料,研究了颗粒细胞单层(GCM)和培养微滴大小对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类,分别在体外成熟(IVM)和早期胚胎的体外培养(IVC)培养液中添加GCM,与不添加的对比;添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率无明显影响,但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。试验2将取自每头牛的约20枚卵母细胞,分别置于不同大小的微滴(30μl,50μl,100μl和200μl)中培养、受精,30μl和50μl组的囊胚发育率明显高于100μl和200μl组。     

Characterization of polyclonal antibodies against nonstructural protein 9 from the porcine reproductive and respiratory syndrome virus

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is considered to be one of the most important infectious diseases impacting the swine industry and is characterized by reproductive failure in late term gestation in sows and respiratory disease in pigs of all ages. The nonstructural protein 9 gene, Nsp9, encoding the RNA-dependent RNA polymerase, is generally regarded as fairly conserved when compared to other viral proteins. Antibodies against Nsp9 will be of great importance for the diagnosis and treatment of the causal agent, PRRS virus. A study was undertaken to generate polyclonal antibodies against the immunodominant Nsp9. For this purpose, the Nsp9 was expressed in Escherichia coli and subsequently used as an antigen to immunize New Zealand rabbits. Antiserum was identified via an indirect ELISA, and then verified based on the ability to react with both naturally and artificially expressed Nsp9. Results of virus neutralization test showed that this antiserum could not neutralize the PRRSV. Nevertheless, this antiserum as a diagnostic core reagent should prove invaluable for further investigations into the mechanism of PRRS pathogenesis.     

禽流感疫苗免疫商品代蛋鸡免疫抗体水平和消长规律检测

将6批次的商品代蛋鸡13 700羽分成6个试验组,用6种不同的禽流感疫苗分别接种商品代蛋鸡,疫苗免疫之后每间隔2周采血分离血清,检测禽流感H5和H9的抗体滴度和抗体持续期.结果表明HVK-2、SDYB、ZZZM三个试验组的H5抗体在免疫后的第2周达到4log2以上,CDJH和HVK-1两个试验组的H5抗体接近4log2,到第4周时,抗体滴度达到峰值,以后逐渐下降,而HVK-3试验组则几乎测不到H5抗体.H9抗体在疫苗免疫后2周全部达到5log2以上,HI抗体滴度普遍高于H5.对5组试验鸡分别进行了2次禽流感疫苗免疫,经过加强免疫的H5抗体水平普遍高于一免,并且抗体持续期明显延长.     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

用基因疫苗pcDNA-H9、纯化H9N2亚型AIV和重组噬菌体T4-H9HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6)、H9-02(3B1)、H9-03(3H11)、H9-04(1A4)、H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01、H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。为进一步分析H9N2亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。     

左旋咪唑影响流感灭活疫苗（H9N2）抗体滴度

为了研究不同剂量的左旋咪唑对鸡流感病疫苗免疫效果的影响,将20只17日龄雏鸡,随机分成A、B、C、D四组,每组5只.分别皮下注射H9N2灭活疫苗0.5ml/羽,同时给试验组A(0.6mg)、B(0.3 mg)、C(0.15 mg)剂量的左旋咪唑,D组注射生理盐水作为对照.免疫后0、7、14、21和28天,翅下静脉采血检测抗H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度.结果表明,给药组的抗体水平都明显高于对照组;不同给药剂量的组别的抗体水平也存在差别,0.6 mg、0.3 mg剂量组鸡只平均抗体水平基本一致,却明显低于0.15 mg的低剂量组.这表明左旋咪唑影响H9N2流感病毒疫苗抗体滴度,低剂量(0.15 mg)添加左旋咪唑,可提高疫苗的抗体水平.     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

监测重组蛋白EgM9免疫犬的特异性抗体变化

[目的]探索EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律.[方法]利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG、IgGi,IgG2,IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证.[结果]经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1,IgG2,差异极显著(P <0.01),而特异性抗体IgA,IgM和IgE差异不显著(P > 0.05).[结论]证实EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答.     

单抗介导的血凝试验对H9N2亚型禽流感病毒的研究

利用4株鼠源抗H9N2禽流感病毒血凝素单克隆抗体与标准H9N2禽流感多克隆抗体,通过血液凝集抑制试验(Haemoglutination inhibition test,HI)分别对25株H9N2禽流感病毒进行了检测,发现4株单克隆抗体均对其中的23株H9N2禽流感病毒反应,其最高HI效价分别为:A单抗12log2,B单抗12log2,C单抗12log2,D单抗12log2;最低分别为:A单抗3log2,B单抗9log2,C单抗4log2,D单抗6log2,而对其中的2株H9N2禽流感病毒没有HI反应,其HI价均为0;然而,标准多抗对25株H9N2禽流感病毒均产生HI反应。检测结果表明2株H9N2AIV毒株血凝素蛋白出现了抗原漂变。     

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性.